细胞实验必读：流式细胞技术的实验设计及流程详解|MCE

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Section.01

流式细胞术

流式细胞技术是一种对悬浮在流体中的单个细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。

图 1.流式细胞术原理图[1]。

此外，具备分选功能的仪器还能通过使液滴带电的方式，将特定目标细胞精准分离出来，从而实现高速、高纯度的细胞分选，广泛应用于免疫学、肿瘤学等研究领域。

Section.02

对照组设计

对照组的设置是实验的基石，其根本目的是确保实验结果的特异性、准确性和可解释性。

阴性对照

• Blank Control：空白对照/未染色对照，不加任何抗体的细胞。用来确定阴性细胞群的物理特性(大小、颗粒度)，作为调节电压的初始参考，并观察细胞的自发荧光背景。
  
  

• Isotype Control：同型对照，使用与一抗同种属、同亚型、同标记的非特异性抗体，用于排除抗体的非特异性结合。
  
  

生物学对照

• Positive/Negative Control：阳性/阴性生物学对照，已知表达/不表达目标抗原的细胞样本。
  
  

Section.03

实验流程

第一步：样本制备

『全血/PMBC』

1.红细胞裂解：使用红细胞裂解液，在染色后或染色前裂解红细胞。注意裂解后需用 PBS 充分洗涤。

2.密度梯度离心(如 Ficoll)：用于分离 PBMC，可获得高纯度的淋巴细胞。

『细胞系』

1.贴壁细胞系：用胰酶(含 EDTA)消化细胞。在显微镜下观察，当细胞变圆、间隙变大时，加入含血清的完全培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使其脱离培养皿表面，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管，300-500g 离心 5 min，弃上清，PBS 重悬洗涤。

2.悬浮细胞系：直接收集细胞培养液，300-500g 离心 5 min，弃上清，PBS 重悬洗涤。

『组织样本』

1.机械分离：在含血清的培养基或 PBS 中，用注射器活塞、研磨棒或 70μm 细胞筛网研磨。

2.酶学消化：对于致密组织(如实体瘤)，使用胶原酶、DNA 酶等混合酶液在 37°C 下消化 15-45 min，以解离细胞。注意处理后必须过70μm滤网，以去除细胞团块和碎片。

第二步：细胞计数与活力检测

『细胞计数』

使用血球计数板或自动细胞计数仪进行计数。

1.取少量细胞悬液，与台盼蓝或自动细胞计数仪专用染料混合。

2.进行计数，并计算细胞浓度和活力。活力应高于 90%。

『活力检测』

『原理』：死细胞容易与抗体非特异性结合，使用活性染料可以区分活细胞和死细胞，并在数据采集和分析过程中排除死细胞。

第三步：固定和透化

『原理』：固定步骤是为了保留细胞内蛋白质的结构。 通透步骤会破坏细胞膜，使抗体进入细胞并对细胞内靶点进行染色。对细胞内靶点进行染色时，须进行额外的固定和通透步骤。

图 2. 固定和透化模式图。

『固定』

『操作』：

1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛冰上固定细胞 15 ~ 20 min；

2. 洗涤：减速离心细胞(200 x g, 5 min, 4°C)得到沉淀，弃去上清液，并在洗涤缓冲液中重悬沉淀。清洗 3 次，以去除残留的固定液。

表1.常用固定试剂

『透化』

『操作』：

1.一边温和涡旋细胞，一边向细胞中缓慢添加预冷的甲醇，使细胞透化。

2.在冰上透化 10-20  min。

表2.常用透化试剂

第四步：封闭

『操作』：

1.减速离心细胞(200 x g，5 min，4°C)得到沉淀，弃去上清液。

2.加入封闭缓冲液，轻轻吹打混匀重悬沉淀。4'℃ 避光孵育细胞 30-60 min。

第五步：抗体孵育

该步骤用使抗体充分与目的蛋白抗原结合，决定了荧光信号的位置和特异性，进而影响实验结果的准确性和可靠性。

该步骤可选择 (i)直接检测：一抗直接与荧光基团偶联。(ii) 间接检测：使用合适的荧光标记二抗检测一抗。这两种方法各有优点和缺点。

图 4. 直接法和间接法示意图。

『操作』：(以直接检测为例)

1.孵育：冰上或 4°C 避光孵育 20-30 min。

2.洗涤：加入过量洗涤缓冲液，离心(300-400g, 5 min)，弃上清。重复 1-2 次以去除未结合的抗体。

第六步：上机检测

抗体孵育后，将细胞充分重悬于适量 PBS 或鞘液中进行上机检测。

参考文献：[1] Zand E et al. Potential of Flow Cytometric Approaches for Rapid Microbial Detection and Characterization in the Food Industry-A Review. Foods. 2021 Dec 15;10(12):3112.