蛋白酶抑制剂 Cocktail 的 IP实验 WB实验参考文献 | MCE

mce

蛋白酶抑制剂 Cocktail (EDTA-Free, 100× in DMSO) 可以用于细胞或组织提取物用来增加蛋白稳定性。在稳定环境下内源性蛋白的产生和降解通常处于动态平衡，在细胞水平上趋于稳定。而在体外研究中，蛋白的降解风险会增加，为防止蛋白降解，可以添加小分子抑制剂来阻断蛋白降解，货号：HY-K0010；https://www.medchemexpress.cn/inhibitor-kit/protease-inhibitor-cocktail.html（官网搜索了解详情）。

蛋白酶抑制剂 Cocktail (EDTA-Free, 100× in DMSO) 由 6 种蛋白酶抑制剂混合制成，用于保护蛋白的完整性。可用于蛋白质免疫分析 (WB)、免疫沉淀 (IP)、免疫共沉淀 (Co-IP)、pull-down、免疫组织化学 (IHC)、免疫荧光 (IF)、激酶研究等多种分析。

价格比较

操作流程

蛋白酶抑制剂使用前需在室温下解冻，按照 1:100 (v/v) 的比例将该抑制剂混合物加入到裂解液中，混匀即可。

IP实验、WB实验参考文献

1、Neuro Oncol. 2024 Aug 2:noae147. doi: 10.1093/neuonc/noae147.

肿瘤微环境中低水平的肿瘤坏死因子α维持了 Vasorin 介导的糖酵解对胶质瘤干细胞的自我更新

在T4121和WF19 GSCs中共同免疫沉淀TNFR1或VASN，并对TNFR1和VASN进行免疫印迹。IgG被用作IP的对照抗体。

背景： 胶质瘤干细胞 （GSC） 的自我更新是导至胶质母细胞瘤 （GBM） 治疗耐药和复发的原因。肿瘤坏死因子 α （TNFα） 和 TNF 信号通路在临床前模型和肿瘤患者中显示出抗肿瘤活性。然而，根据胶质瘤基因组图谱数据库，TNFα对胶质瘤临床预后没有意义。本研究旨在探讨肿瘤微环境的 TNFα是否能维持 GSCs 的自我更新，促进胶质瘤患者预后较差。

方法： 采用空间转录组学、免疫印迹、球体形成试验、极限稀释和基因表达分析来确定 TNFα对 GSC 自我更新的作用。采用质谱、RNA 测序检测、生物信息学分析、qRT-RNA、免疫荧光、免疫组化、单细胞 RNA 测序 、体外和体内模型等手段，揭示了 TNFα诱导的 GSC 自我更新机制。

结果： 低水平的 TNFα 对 GSC 自我更新和更差的神经胶质瘤预后具有促进作用。在机制上，Vasorin （VASN） 通过增强糖酵解介导 TNFα 诱导的自我更新。糖酵解产生的乳酸抑制肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的 TNFα分泌，并将 TNFα维持在较低水平。

结论： VASN 介导的 TNFα诱导的 GSC 自我更新为内源性 TNFα效应对 GBM 的失败提供了可能的解释。靶向 VASN 和 TNFα抗肿瘤作用相结合可能是治疗 GBM 的有效方法。

2、Mol Cancer. 2024 Apr 4;23(1):70. doi: 10.1186/s12943-024-01985-1.

治疗诱导的衰老肿瘤细胞来源的细胞外囊泡通过 SERPINE1 介导的 NF-κB p65 核易位促进结直肠癌进展

全细胞裂解物和 EV 中 EVs 标志物和内质网标志物的蛋白质印迹分析。

背景： 细胞衰老在抗癌治疗过程中经常发生，持续性衰老肿瘤细胞 （STC） 通过衰老相关分泌表型 （SASP） 的旁分泌不利地促进肿瘤进展。细胞外囊泡 （EV） 最近作为 SASP 的新组成部分出现，主要介导 SASP 的肿瘤促进作用。值得注意的是，STC 释放的 EV 对肿瘤进展的潜在影响在很大程度上仍然未知。

方法： 我们收集了两组结直肠癌 （CRC）患者的肿瘤组织，以检查抗癌治疗前后 p16、p21 和 SERPINE1 的表达。队列 1 包括 22 名在手术切除前接受新辅助治疗的局部晚期直肠癌 （LARC） 患者。队列 2 包括 30 名接受一线含伊立替康治疗的转移性 CRC （mCRC） 患者。通过 CCK-8、transwell、伤口愈合试验和肿瘤异种移植实验，确定 STC 释放的 EVs 对 CRC 进展的影响。采用定量蛋白质组学分析鉴定 STCs 分泌的 EVs 内蛋白质货物，利用免疫沉淀和质谱仪鉴定来探索 SERPINE1 的结合伙伴。通过免疫共沉淀验证了 SERPINE1 与 p65 的相互作用，并通过免疫荧光证实了它们的共定位。

结果： 化疗药物和辐照可以在体外和人 CRC 组织中有效诱导 CRC 细胞衰老。抗癌治疗后患者 p16 和 p21 表达的更显着升高显示出 LARC 的无病生存期 （DFS） 或 mCRC 的无进展生存期 （PFS） 较短。我们观察到，与非 STC 相比，STC 释放的富含 SERPINE1 的 EV 数量增加，这进一步促进了受体癌细胞的进展。用特异性抑制剂替普拉施汀靶向 SERPINE1，显着减弱了 STCs 衍生的 EV 的肿瘤促进作用。此外，抗癌治疗后 SERPINE1 表达增加较多的患者，LARC 的 DFS 或 mCRC 的 PFS 较短。从机制上讲，SERPINE1 与 p65 结合，促进其核易位并随后激活 NF-κB 信号通路。

结论： 我们提供了治疗诱导的衰老的临床预后意义的体内证据。我们的结果表明，STC 通过产生大量富含 SERPINE1 的 EV 来导至 CRC 进展。这些发现进一步证实了治疗诱导的衰老在肿瘤进展中的关键作用，并为 CRC 治疗提供了潜在的治疗策略。

3、Cell Mol Immunol. 2024 Aug 20. doi: 10.1038/s41423-024-01203-4.

工程线粒体作为癌症疫苗平台发挥强大的抗肿瘤免疫作用

在蛋白酶抑制剂混合物（HY-K0010）和磷酸酶抑制剂混合物 II（HY-K0022）存在下，用 RIPA 缓冲液裂解 cels，煮沸 10 min。

B16-F10 细胞线粒体中 OVA 或 TRP2 水平的免疫印迹分析，或用携带线粒体的模型抗原（OVA 或 TRP2）构建稳定的 B16-F10 细胞系。抗 VDAC1 用作负载控制。

优选的抗原递送谱伴有足够的佐剂有利于疫苗效率。线粒体具有原核特征并含有各种损伤相关分子模式 （DAMP），很容易被吞噬细胞吸收并同时激活先天免疫。

在目前的研究中，我们建立了一个线粒体工程平台，用于生成富含抗原的线粒体作为癌症疫苗。以卵清蛋白（OVA）和酪氨酸酶相关蛋白 2（TRP2）为模型抗原，与线粒体定位信号肽合成融合蛋白。然后采用慢病毒感染系统生产含有 OVA 或 TRP2 的线粒体疫苗。

提取了含有 OVA 和 TRP2 的工程线粒体（OVA-MITO 和 TRP2-MITO）并评估为潜在的癌症疫苗。令人印象深刻的是，工程化线粒体疫苗在小鼠肿瘤模型中用作预防和治疗疫苗时显示出有效的抗肿瘤作用。

在机制上，OVA-MITO 和 TRP2-MITO 有效招募和激活树突状细胞 （DC），并诱导肿瘤特异性细胞介导的免疫。此外，线粒体疫苗对 DC 的激活关键涉及 TLR2 通路及其脂质激动剂，即源自线粒体膜的心磷脂。

结果表明，工程化线粒体是天生精心编排的载体，充满了抗原递送的免疫刺激剂，可以更优选地靶向局部树突状细胞并发挥强大的适应性细胞免疫。这项概念验证研究建立了一个通用的疫苗构建平台，该平台具有携带癌症和其他疾病可改变抗原的工程线粒体。