SDS-PAGE与Western Blot

空白派

欢迎各位来到今天的教学。咱们的目标非常明确：教会你们如何像一位经验丰富的老手一样，解读凝胶电泳（Gels）和蛋白印迹（Blots）的结果。

你们将学习从一张看似简单的凝胶图中，准确提取关于蛋白的大小、纯度、相对丰度这三大核心信息。

更重要的是，你们将掌握这项技术的边界和陷阱，学会如何利用Western Blot精准验证蛋白身份，并避免那些足以让你的结论跑偏的“过度解读”。

包含两个核心技术环节：SDS-PAGE和Western Blotting。

SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）的原理，可以理解为一场“蛋白质障碍赛跑”。

我们用SDS这种洗涤剂给所有蛋白质“穿上”了带有相同负电荷的“外套”，消除了它们自身电荷的差异，然后让它们在一个充满网格的凝胶（gel）里，向正极奔跑。

在这场比赛中，唯一的决定因素就是“体型”：小个子（低分子量）跑得快、跑得远；大块头（高分子量）则被网格缠住，跑得慢、跑得近。

Western Blotting（蛋白印迹）则是对这场比赛结果的“身份核实”。

我们把凝胶里的所有蛋白质“复印”到一张膜（membrane）上，然后用一个只认识特定目标的“侦探”——也就是特异性抗体——去寻找我们感兴趣的那个蛋白质。如果它在，侦探就会结合上去并发出信号。这样，我们就能在众多条带中，准确地指出“嫌疑人”的位置和大致数量。

所需材料与试剂  

类别	名称/规格	用途说明
仪器设备	电泳槽、电转槽、电源、成像系统	进行凝胶电泳、转膜及结果成像。
核心耗材	预制胶或制胶试剂、PVDF/NC膜、滤纸	电泳介质、蛋白承载膜、转膜辅助材料。
SDS-PAGE试剂	蛋白上样缓冲液、电泳液、蛋白Marker	样本变性、电泳缓冲、分子量标准。
考马斯亮蓝染色液/丽春红S	总蛋白染色，用于评估上样量和转膜效率。
Western Blot试剂	转膜液、封闭液 (5%脱脂奶粉)、TBST洗涤液	转膜、封闭非特异性位点、洗去未结合抗体。
一抗、二抗 (HRP标记)、ECL发光底物	特异性识别靶蛋白、信号放大、化学发光检测。

具体操作步骤


样本制备与上样


将你的蛋白裂解液（约20-40 μg总蛋白）与5X蛋白上样缓冲液按4:1的体积比混合均匀。

将混合物在95-100°C金属浴中加热5-10分钟，使蛋白质充分变性。

冷却至室温后，短暂离心，将样本小心地加入到SDS-PAGE凝胶的上样孔中。别忘了在第一个孔或最后一个孔加入蛋白分子量标准（Marker）。

  Note
上样缓冲液中的蓝色染料（溴酚蓝）是你的追踪指示剂，它本身不染蛋白，只是让你能看到上样过程和电泳前沿。加热是为了让蛋白质解折叠并带上均匀的负电荷，这是分离的关键。
  <br/>2 凝胶电泳

将装有凝胶的电泳槽置于冰上，并倒入电泳液，确保内外槽液面齐平。

连接电源，以较低电压（约80V）使样品通过浓缩胶，待样品进入分离胶后，调高电压（约120V）进行分离，直至溴酚蓝染料到达凝胶底部边缘。

  【重要提示】
选择合适的凝胶浓度至关重要。如果要分离大分子蛋白（>100 kDa），使用低浓度胶（如7.5%）。如果要分离小分子蛋白（<30 kDa），则需要高浓度胶（如12%或15%）。（别问我用错胶跑成一坨的经历，都是泪啊）
  <br/>3 转膜 (Protein Transfer)

小心地撬开凝胶板，切除浓缩胶部分。

按照“黑板-滤纸-凝胶-膜-滤纸-白板”的顺序组装“三明治”结构，并用滚筒赶走所有气泡。

将夹子放入预冷的转膜液中，在冰浴条件下进行电转（湿转通常为100V，60-90分钟）。

⚠️ Warning!
方向绝对不能错！凝胶靠近负极（黑板），膜靠近正极（白板/红板）。搞反了你的蛋白就全跑到缓冲液里去了，这一天的活儿就白干了。
气泡是转膜的天敌，任何一个气泡都会导致那块区域的蛋白转印失败，出现一个难看的“空洞”。
  
4 免疫印迹 (Immunoblotting)

封闭： 将膜浸入5%脱脂奶粉（或BSA）的TBST溶液中，在室温下摇晃1小时。这一步的目的是用无害的蛋白质把膜上所有可能粘附抗体的地方都“占满”。

孵育一抗： 用封闭液稀释你的特异性一抗，与膜一同在4°C下孵育过夜或室温孵育2小时。

洗涤： 用TBST洗涤膜3次，每次10分钟。这一步非常关键，它能洗掉那些没有牢固结合的一抗，降低背景信号。

孵育二抗与信号检测： 孵育HRP标记的二抗1小时，再次用TBST洗涤3次。最后，滴加ECL化学发光底物，立即放入成像系统中进行曝光和拍照。
  
实验结果分析与预期：敲黑板，这是整个实验的点睛之笔。
我们来分析一下你可能得到的两种图：

1. 总蛋白染色图（考马斯亮蓝或丽春红）：

- 看纯度： 如果你在纯化蛋白，理想结果是只有一条清晰的带。杂带越多，说明样品越不纯。底下有拖尾或弥散的条带，可能意味着你的蛋白降解了。  
- 看大小： 条带位置可以和Marker对比，估算蛋白分子量。但请记住，这只是表观分子量，翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）会让它跑得比理论值要慢（显得更大）。  
- 看上样量： 丽春红染色可以初步判断每个泳道的总蛋白上样量是否一致，这是后续定量分析的基础。  
⚠️ 解读陷阱
总蛋白染色无法确定条带身份。那条最亮的带，不一定就是你想要的蛋白，可能只是细胞里某个丰度极高的“路人甲”。

  2. Western Blot发光图：

- 看特异性（身份确认）： 理想情况是在你预期的分子量位置出现一条孤立的、清晰的条带。这证明你的目标蛋白确实存在。  
- 看相对定量： 在确保上样量一致的前提下（通过内参蛋白，如GAPDH或β-actin的条带强度来校准），你可以比较不同处理组之间目标条带的亮度，来判断蛋白表达量的相对变化（上调或下调）。

  ⚠️ 解读陷阱

- 抗体不完美： 出现多条杂带是常事，说明抗体可能存在交叉反应。你需要结合阳性/阴性对照（比如过表达或敲除的样本）来确认哪条才是你的目标。

- 没有内参的定量是“流氓行为”： 如果你没有用内参蛋白来校准，那么你观察到的条带变强，可能仅仅是因为你这个孔的“上样手抖多加了”。

实验“彩蛋”
1. 组合拳的力量： 发表文章时，并排展示你的Western Blot结果和对应的内参（Loading Control）结果，是展示实验严谨性的“黄金标准”。如果能再附上一张丽春红染色图证明各泳道总蛋白上样均匀，那你的图就无懈可击了。

2. 万能的求助对象： 当你遇到杂带多、背景高、没信号等疑难杂症时，除了求助师兄师姐，别忘了抗体说明书（Datasheet）和抗体公司的技术支持。他们通常有针对该抗体的优化条件和故障排除指南，能救你于水火。

祝各位实验顺利，结果漂亮！


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