Q-PCR实验操作流程

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Q-PCR实验流程
一、 ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、 总RNA抽提
1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;
如使用组织样品，则先用液氮充分研磨组织样品，然后加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)
2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致)
3) 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)
4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀)，室温静置10min;
5)4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀)，去上清;
6)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，超净台风干;沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
三、去基因组
使用RNase-free的DNase І(Promega)，按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。

RNA DNase І 10 x buffer H2O(RNase free)RNasin	30201039.50.5	µlµlµlµlµl
总体积	100	µl

然后按以下步骤操作：
1) 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min后， 14,000rpm离心15min，取上清。
2) 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。
3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，-20℃静置15min;
4)4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清;
5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干;
6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
四、总RNA纯度和完整性检测
1)纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。
2)总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。

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