怎么根据靶点蛋白质的结构设计药物？

空白派 · 发表于 2025-5-27 21:59

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根据靶点蛋白质的结构，怎么设计相应的药物呢，用什么方法？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/32089386

同花顺 · 发表于 2025-5-27 22:00

参考链接：https://www.youtube.com/watch?v=wIHwHDt2NoI
论文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.12.09.519842v1.full.pdf
代码链接：https://github.com/RosettaCommons/RFdiffusion

背景

1. 介绍

蛋白质设计意义重大。目前深度学习方法主要在序列设计，脚手架功能位点设计，环低聚物设计以及抗体设计等多方面取得较大进展。但目前并没有提出一个通用的框架用来应对各类广泛的蛋白质设计任务。而且目前还没有技术能做到从头结合剂设计以及高阶对称环聚物的设计。
本文则提出了一个基于扩散模型的通用的蛋白质设计框架，结果显示该框架在各类任务中均优于已有的方法，且能实现从头结合剂设计以及高阶对称环聚物的设计。
序列设计：已知蛋白质骨架结构，设计出能折叠成该骨架的蛋白质序列。
脚手架功能位点设计：创建一个稳定的支架来支持目标基序。在这里，motif是具有生物学功能的结构蛋白片段，而scaffold则稳定了motif的结构
环低聚物设计：环状蛋白低聚物在几乎所有的生物过程中都起着关键作用，占蛋白质数据库(PDB)中所有沉积结构的近30%。可用于小分子结合和催化以及纳米笼装配的构建。这种环状组合蛋白可用于药物载体或者递送系统，例如纳米颗粒疫苗（组装蛋白可以携带抗原形成一个类似病毒颗粒的小球，从而呈现携带的抗原，激活体内的免疫反应）
抗体设计：根据抗原结构等信息设计抗体相关信息。

2. 一般的蛋白质设计流程：

蛋白质骨架设计->序列设计->模拟筛选->实验测定

对于蛋白质骨架设计分各种使用场景有不同的设计方式。最早的骨架设计是给定想要的二级结构，例如几条 $\alpha$ 螺旋，几条 $\beta$ 折叠，然后根据能量（2022年中科大发表在nature上的一篇就是用这种方式进行设计的）或者从已有蛋白质数据库中采样得到可能的骨架结构。还有根据已有的功能位点进行inpainting或者幻化设计等,这两种方式可以根据已有的功能位点即得到生成后的结构也会得到生成后的序列信息。

Hallucination

给定功能位点处的氨基酸类型以及结构，设计出能包含有该功能位点的整体蛋白质的结构。
根据motif进行蛋白质设计：

环状低聚物设计：

2. Inpating

dist：距离损失，aa: 氨基酸类型的损失，tors: 扭转角的损失， FAPE: 结构坐标损失， lddt: 另一种结构损失。
以上所有结构损失应用在蛋白质的所有氨基酸上，只有序列损失应用在mask的氨基酸上。

3. RosettaFold2

RosettaFold的模型结构图

RosettaFold2的模型结构图

Rsettafold2的改进内容：

使用三重框架，其中3d信息的初始化来自模板结构。
根据3d信息更新pair信息。
在1d,2d,3d增加attention交互信息。
增加recycle操作，不断更新input embedding。

正文

在此默认大家已经掌握扩散模型相关知识。

1. RFdiffusion的扩散框架介绍

RFdiffusion的目的是为了生成蛋白质骨架结构，所以本文对于骨架结构的生成看成是每个氨基酸局部坐标系相对于全局坐标系而言的旋转矩阵R和平移向量Z的生成。因为氨基酸局部坐标系一般都是以 $C_\alpha$ 原子为坐标原点，所以平移向量Z相当于就是 $C_\alpha$ 原子在全局坐标系下的坐标。

1. 预测过程

-公式1
作者近似的将旋转和平移视为独立分布的变量，并用实验证明了这样效果是最好的。
在使用公式1时，需要注意扩散模型需要保证公式2，即在全局坐标系发生旋转和平移时，预测的结果也应当发生相同的旋转和平移。其中 $R * x = [Rz,Rr]$

-公式2

2. 加噪去噪过程

平移向量加噪：直接在每一步扩散过程中引入高斯分布噪声，和普通的DDPM别无二致。
加噪：

平移向量去噪：

旋转矩阵加噪：特殊加噪，因为SO(3))是一个紧化的黎曼流形，其上的典型高斯分布不明确，所以之前推导的高斯分布下推导的各类式子不能适用。这里将生成建模扩展到黎曼流形上，并将扩散过程定义为在流形上的布朗运动。
加噪：

旋转矩阵去噪：

3. loss计算

平移损失：

旋转损失：个人的一些理解：根据代数几何可知，下试减号右侧相当于将1向量先旋转r矩阵，然后再旋转r&#39;^T,如果r&#39;和r不一致，则旋转后的向量将会和1向量之间有夹角，否则应当重合。这里衡量了旋转后两向量之间的欧氏距离。

4. Self-Condition

是模型训练过程中的一个trick，如下所示，其中50%的样本走正常流程，即根据 $x_t$ 预测的 $x_0$ 计算loss。剩下50%的样本会先通过 $x_t$ 预 $x_0$ ，然后根据 $x_{t+1},x_0$ 预测 $x_t(x_0)$ ，再通过 $x_t(x_0)$ 以及 $x_0$ ,预测更新一层的 $x_0(x_t(x_0),x_0)$ ，从而形成 $x_0$ 的自循环。

5. 扩散模型伪代码

2. 无条件蛋白质单体生成

先对RosettaFold2进行训练，之后载入训练好的RosettaFold2的模型再在单体数据集上进行无条件结构生成训练。

1. RosettaFold2的训练

数据集：PDB库中单体/低聚物数据；异质多聚物数据；Alphafold预测pLDDT > 0.7的数据；随机采样的负bind样本。比例为：2：1：4：1
loss组成：(MLM) loss, distogram (dist) prediction loss, FAPE loss, accuracy estimation loss, bond geometry loss and van der Waals (vdW) energy loss

2. RFdiffusion Training

在单体数据集上训练，具体训练超参如下：RFdiffusion trains to convergence when initialized from RF2 weights in ~5 epochs

3. 结果

左图显示，RFdiffusion和hallucination相比，性能要高出很多。
右图显示，RFdiffusion在训练时的各种策略对结果的影响。

当去掉预训练时，性能下降很多。
去掉self-condition时，性能下降很多。
去掉mse loss，将mse loss替换为FAPEloss时，也下降很多。

3. 通过显式对称去噪的高阶低聚物设计

1. 功能描述

设计出一些满足对称结构的环状低聚物。该低聚物可以用来做疫苗平台，药物运输和催化剂。
在给定单体条数，以及单体序列长度后，通过RFdiffusion设计出可行的对称环状低聚物。

2. 实现方式

点群对称性可以用旋转矩阵的有限集合来表示，我们可以用围绕z轴旋转(360/K)°的旋转矩阵集合来表示K阶循环对称组

即对于一个多聚体 $X = [x^1, ...,x^K]$ .
对于其中的某一个单体 $x^k=([z_1^k,...,z_M^k],[r_1^k,...,r_M^k])$
则只要重建出 $x^1$ ,完整的多聚体如下所示：

重建 $x^1$ 则利用无条件生成的方式进行重建即可。
与之前的幻化方式相比，提高了对称的精确性，并且节省了内存和计算。

3. 结果

A图显示不同情况下设计的堆成环聚物的结构展示。
B,C图从左到右依次为RFdiffusion预测的结构；AF2通过proteinmpnn预测的序列，再预测结构得到的示意图；电镜下2D类平均值;电镜下的3D示意图。从这些图中可以看出实际结构与设计非常接近。
E图：二十面体有60个亚基排列在2重、3重和5重对称轴周围。在被选中进行实验验证的48个二十面体中，有一个被nsEM确认形成预期的装配。像HE0902这样的设计(以及未来类似的大型组装)应该可以作为新型纳米材料和疫苗支架，具有强大的组装能力

在辅助链间和链内接触电位的引导下(看第7节内容)对性能的影响

4. 包含功能位点的脚手架设计

1. 功能描述

已知某段连续或者不连续的功能位点的氨基酸信息以及结构信息，创建一个稳定的支架来支持功能位点。如下图所示。

2. 实现方式

设功能位点的坐标为 $x^{M}$ ,骨架坐标 $x^{S}$ ,则最终要构建的完整的坐标为 $x_0=[x_0^M,x_0^S]$ 。
目标是：

3. 训练方式

从pdb数据库中随机选择一 $x_0$ .
将 $x_0$ 序列随机分割为 $x_0=[x_0^M,x_0^S]$ ，遵循RF diffusion .
给骨架坐标上加噪。
计算出在给定 $x_0^M$ 时的loss.

为了鼓励功能位点上的结构信息不发生改变，所以我们在预测$$$$x_0^S $$$$时，每一步去噪中用的功能位点的输入坐标信息即为原始坐标信息，并且还会引入功能位点的侧链扭转角以及氨基酸序列信息。并同时计算在功能位点和骨架上的预测损失。

4. 结果

绿色部分为已知的要包含的功能位点，彩色的为 AF2 prediction of an RFdiffusion design。

5. 脚手架酶活性位点

1. 功能描述

蛋白质设计中的一个重大挑战是构建出包含少量单氨基酸的酶活性位点的骨架设计。RFdiffusion能够在一系列酶类中以高准确率获得包含多个侧链和主干功能基团的支架酶活性位点。
实现方式

对酶活性位点支架进行微调的RFdiffusion版本是从训练了5个epoch的基本版本（uncondition）开始训练的
在微调过程中，30%的任务来自基本模型任务集，其他70%是三重接触任务，其中随机选择3个残基，这三个残基的要求是：与该残基Cβ-Cβ距离小于6Å的残基数量大于10个残基。则这样的残基可被选择为具有活性位点的残基。最后随机选中的这三个残基作为功能位点进行后续的骨架的生成。
选中的残基会有50%的概率保留侧链信息。
加大对于功能位点处位移损失的权重，这个权重设置为10。在这里加大权重的原因是，该任务的功能位点长度过短，所以需要尽可能保证在功能位点处的不变性。

2. 结果

如下所示为不同酶的类型下生成的产物的展示。
其中G图展示的是在不同酶类型下，设计的成功率的占比。成功的设定规则为：AF2 Motif RMSD vs native: backbone < 1Å, backbone and sidechain atoms < 1.5Å, RMSD AF2 vs design < 2, AF2 pAE < 5

6. 全新蛋白和肽结合剂设计

1. 功能描述

设计靶向蛋白的高亲和力结合物是蛋白质设计中的一个巨大挑战，具有许多治疗应用。最近描述了一种基于物理的Rosetta方法，仅从目标结构信息重新设计结合剂到蛋白质结合剂的通用方法。随后发现利用ProteinMPNN进行序列设计，利用AF2进行设计滤波，提高了设计成功率。然而，实验成功率很低，每次设计活动都需要数千种设计进行筛选，而且这种方法依赖于预先指定一组特定的蛋白质支架作为设计的基础，这内在地限制了可能解决方案的多样性和形状的互补性。据我们所知，还没有一种深度学习方法在设计完全从头开始的粘合剂方面显示出实验上的普遍成功。

2. 实现方式

从base model（uncondition）上接着训练.
其中50%的数据来自复合物，50%的数据来自单体数据。
当数据为复合物数据时，只对其中一条链进行加噪，另一条链保持固定。并且还会提供hotspot residues的索引。hotspot residues的选取为与另一条链 Cβ-Cβ的距离包含在10Å以内。
在训练时，50%的时间会引入加噪对应链的二级结构信息。剩下50%的时间会引入块邻信息。
在训练时，会对二级结构信息或者块邻信息进行mask(0-75%)。以便在预测时，提供不够精确的二级结构或者块邻信息。

3. 结果

B图：在浓度 $K_d <= 10 μm$ 时，如果响应大于K_d = 10 μm时的响应时，认为具有更高的亲和力。
C图：和以往的方式相比，该文的方法比已有的方法的实验成功率要高很多。
D图：不同靶点下，RFdiffusion设计的结果展示。

7. 用外部电位引导RFdiffusion推断

对于对称环状低聚物进行设计时，除了进行单体生成外，还希望借助外部点位引导最终的低聚物的设计。该过程只作用在预测过程。
整体思想是，根据扩散模型中的classifer guidance的条件引导思想。在进行去噪时，除了沿着数据分布方向进行采样外，还需要沿着向目标类型靠近的方向进行移动。

在本文中，也构造一种想要的目标，最后沿着该目标的方向进行采样生成。

对于环状低聚物设计的额外目标可以用下列式子表示：如下所示，在下列式子的约束下，会优先形成亚单位之间的联系，同时鼓励单个亚单位能够很好的包裹在一起。

因为在高t点上矫正分布偏差足以促进高阶结构中的接触，而在低t点上没有必要继续这样做，因为四元结构已经充分确定，因此我们用guide-scale ( )来衡量外部电力引导

8. 总结

对结构进行扩散时，不是简单的对坐标进行扩散，而是对坐标以及旋转矩阵以不同的方式分别进行扩散。
对模型进行预训练，则给扩散模型带来很大的收益。并且扩散中使用的模型结构，信息的流动方式和预训练相差不大。只在扩散中多增加了时间t这个尺度。
在训练时，使用selfcondition策略提升模型性能。
在训练时，采用mse loss比fape loss效果更好。
对于各种下游任务进行巧妙的训练数据集的构造：酶活性位点，功能位点数据的构造，对接数据是否也能设计出训练数据集。
在进行蛋白质结合剂设计的时候，通过在二维信息上的mask策略，使得最终在结合剂设计时，可以依据想要的二级结构等信息设计出理想的结合剂。我们在进行其他任务设计时，或许也可以将条件刻画为一些基础数据集共有的特征，之后将这个特征进行一些mask.达到在预测时，依据设定特征进行设计的目的。
在进行条件引导时，可增加一些额外的目标函数，使得最终采样样本沿着额外目标函数的方向生成。就像用外部电位引导RFdiffusion推断那样。

大力水手 · 发表于 2025-5-27 22:01

参考文献: Cao L, Coventry B, Goreshnik I, et al. Robust de novo design of protein binding proteins from target structural information alone[J]. bioRxiv, 2021.
解读作者：吴炜坤
一、背景介绍

自从2012年以来，de novo设计靶向结合的蛋白的技术得到了长足的发展。在Rosetta社区过往的一系列文章中，我们可以看出好几个关键技术的交接点，在2020年以前主要以docking-match、motif-graft、fragment重组技术为主，配合酵母展示库的方法对初筛的weak binder进行优化，而在近两年，RIF和深度学习框架厚积薄发，逐渐开始关注全新PPI和高精度的设计方法，其中最具前沿和代表性的工作就是RIF和RFDesign。

设计方法	年代	代表作
InverseRotamer+Match	2011-2015	Computational Design of Proteins Targeting the Conserved Stem Region of Influenza Hemagglutinin
Motif grafting+oligo pool	2016-2020	Massively parallel de novo protein design for targeted therapeutics
FFL/FunFolDes	2018-2020	Proof of principle for epitope-focused vaccine design
RIFdock/RIFgen	2021	Robust de novo design of protein binding proteins from target structural information alone
RFDesign	2022	Wang J, Lisanza S, Juergens D, et al. Deep learning methods for designing proteins scaffolding functional sites

那今天我们就主要来讲一讲基于RIF的通用设计框架的工作原理和成功应用的案例。
二、设计方法

2.1 RIF是什么？

在2011年-2015年期间，产生全新蛋白-蛋白相互作用设计的理念和实践就开始了，但使用的是常规的docking/match-design的方法，其存在最大的问题：hotspot和binding pose的组合空间巨大，通常不能将设计和刚体搜索同时做到，一般只能先考虑1-3个hotspot的组合并优选少量的初始ppi侧链构象，其次再考虑scaffold和受体之间的粗糙的形状互补后进行热点残基和scaffold和“融合”，最后再通过多轮侧链设计和优化。以此只能在非常小的空间内进行搜索，并且该方法较为依赖多样的scaffold数据库。
而今天介绍的基于RIF（rotamer interaction field）的方法早在2014年间就进行了开发。有兴趣的同学可以看最古老的说明文档的PPT：
Legacy - rif 0.1.dev0 documentation简单来说RIF分为rifgen和rifdock两个基本的步骤：rifgen负责在某些小分子或热点氨基酸附近以近乎遍历的方式进行rotamer的生成，特别地是使用rif可以针对极性残基也做优化，这些rotamer信息都被储存在hash table中。

rifdock：使用被对接到指定区域的scaffold库作为输入（可以理解为粗略的形状互补搜索），对每一个binding pose的主链xyz信息与rifgen中巨量的inversed-rotamer进行层级逐渐缩小范围的匹配搜索，对clash、rotamer等指标打分进行排名，优选较好的scaffold binding pose。

作者提出新的通用设计方法，其主要的亮点在于：

采用了更高效的helical extension产生高质量三螺旋骨架库（34507个真。大宝贝）；
由于蛋白-蛋白相互作用主要是疏水的，因此rifgen时只考虑疏水的hotspo stub；
使用patchdock进行快速的形状互补后，接上rifdock，可以找到ddG和cms指标更好的pose;
采用快速的repack+min对rifdock产生的构象进行打分过滤，并且仅考虑Rosetta的疏水相互作用项使得优化速度提升了10倍；
在Interface sequence Design中引入cms（the contact molecular surface） score term，在优化时考虑形状互补以及非极性包埋残基，并且在蒙特卡洛过程中upweight处于ppi界面上氨基酸的score，使得PPI的质量进一步提升；
将质量好的binding motif（连续的）进行分离以及聚类，这一步相当于隐式地考虑了scaffold pose的体积，同时把最有可能结合的热点残基分选；（2000个，有点像binding TERMs的操作）
采用motif-graft的细化搜索scaffold和展开新一轮的界面设计。

整个流程图（包括实验）：

三、测试效果

作者在12个蛋白靶点上进行了相关的测试，均成功设计出能够特异性靶向结合的mini binder，少数的binder更是突破了pM级别，这些binder高度稳定，表面具有明显的净电荷分布。

其中部分结构的解析表明，设计出来结合表位和计算机模型高度一致！

结语

作者开源了所有的rosetta script和database！人人皆可设计binder，或许已经不再遥远。

RIF docking implementation：

https://github.com/rifdock/rifdock

design scripts：

http://files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_design_ minibinders_2021/supplemental_files/scripts_and_main_pdbs.tar.gz
http://files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_design_minibinders_2021/ supplemental_files/computational_protocol_analysis.tar.gz
http:// http://files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_design_minibinders_2021/ supplemental_files/experimental_data_and_analysis.tar.gz

database：

http:// http://files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_design_minibinders_2021/ supplemental_file s/scaffolds.tar.gz

models：

http://files.ipd.uw.edu/pub/ robust_de_novo_design_minibinders_2021/supplemental_files/design_ models_pdb.tar.gz
http://files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_ design_minibinders_2021/supplemental_files/design_models_silent. tar.gz

继续前进 · 发表于 2025-5-27 22:01

正好是我的专业，占个位，稍后来答~
我做过胃溃疡药物和抗癌药物的分子设计的课题，作用靶点分别是质子泵（H*，K*—ATP酶，&#34;*&#34;代表&#34;+&#34;，手机输入法打不出来上标）和σ1&σ2 （sigma 受体）。好吧，不说废话了，进入正题，通俗地讲讲我们在已知药物作用靶点时进行药物设计的一般方法吧。
先简单列个一般流程:
已知受体蛋白质的氨基酸序列（药物和受体重点结合的部位的序列一定要确定，其他影响不大的部位的可以人工模拟）——→ 同源模建（Homology modeling）——→ 分子对接（Molecular docking）——→ 量子力学和分子力场优化（QM/MM optimization）——→ 分子动力学模拟（Molecular dynamics）——→ 广义伯恩表面积算法（MM/GBSA calculation）
未完待续……
以我做过的溃疡药物设计为例来讲讲这个问题。我们设计的是质子泵抑制剂类的溃疡药，首先靶点是很明确的，即质子泵（ H+,K+-ATP酶 ,在胃中分布于胃壁细胞表层 , 排出H+，Cl- 并重吸收K+
，泌高浓度的胃酸，通俗地讲就是胃酸分泌的最后通道，我们设计的药物分子需要与之结合起到阻断胃酸分泌，缓解并治疗各种消化道溃）。
一、同源模建
我们首先从Swiss-Prot数据库(ID:P09626) 中获取猪胃的H+,K+-ATP酶的氨基酸（1033个）序列，利用ClustalW2 算法，通过BLAST在线序列比对（http://
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），选取E2P状态下的 Na+,K+-ATP 酶晶体结构（PBD编码：2ZXE）为模板，使用MODELLER9v4 建立猪的H+,K+-ATP酶的同源模型。H+,K+-ATP酶的结构利用Schrödinger 软件的Protein Preparation Wizard module模块进行处理，再通过PROCHECK程序对最终的优化模型进行验证，以评估蛋白质结构的立体化学的质量。

呃，这个，为什么是猪的胃呢，是因为我们参考的实验数据来自于一些专家的实验室活性研究，而他们的实验用的就是猪胃（总不能拿人胃做实验吧），为了与之对照才建立的是猪胃的质子泵同源模型。
二、分子对接
有报道指出利用Schrödinger 软件的诱导契合对接（IFD）法进行分子对接模拟的方法是一个强大且精准的用来解释配体和受体柔性的方法。IFD程序分为三个步骤：Glide XP 模式被用于初始对接，20个配位体的形态被保留用于蛋白质结构的改进；以三个关键残基（Ala335，Tyr799和Cys813）为中心建立立方体对接盒子；Prime程序用于诱导契合蛋白质- 配体复合物的形成。优化后的复合物根据Prime能量进行分等，能量最低结构通过最后一轮的Glide对接和评估。最后，在默认设置的Glide XP模式下，每个配体再次与的第二步骤中所生成的精细化的低能量受体结构进行对接。IFD分值对占蛋白质- 配体相互作用的能量和该系统的总能量都进行了计算，并据此将对接构型排序。最优的复合物结构进行接下来的QM/MM优化。

三、QM/MM 优化
QM/ MM运算利用QSite程序执行。定义为QM（量子力学）区的配体通过密度泛函DFT / B3LYP（6-31G*基组）计算，而MM（分子力学）区的受体通过截断牛顿法（最大周期为1000;梯度标准为0.01）进行最小化。采用 OPLS 2005 全原子力场。
四、分子动力学模拟

利用Desmond对优化后的的对接模型进行分子动力学模拟。该系统为溶剂化的SPC水分子斜方体盒子，向系统加入平衡离子进行中和，然后进行分子动力学模拟，应用NPT系综执行。采用光滑粒子网状 Ewald 法处理长程静电相互作用，库仑短程相互作用。能量值和轨迹图像分别记录，再用Desmond程序进行MD轨迹分析。最后用PyMOL对最终的配体- 蛋白质复合物可视化，并通过Maestro9.3 进行分析。
五、 MM/GBSA 算法
利用广义波恩表面积（MM/ GBSA）方法计算对动力学最终构相的结合自由能（ΔGbind）。Prime程序中的MM/ GBSA程序用下列方程式计算对接配体的ΔGbind：
DG&#39;bind = DEMM + DG solv
DGbinb = DEMM + D Gsolv-T DS
其中，ΔEMM是复合物间的气相MM能量与蛋白质和抑制剂的能量总和之差，并且包括ΔEinternal（键，键角和二面角能量），ΔEElect（静电能）和ΔEVDW（范德华）的能量。ΔGsolv是溶剂化自由能结合的变化，包括静电自由能ΔGGB（利用广义Born模型计算极性分布），和非静电自由能ΔGSA（溶剂可接近表面非极性自由能贡献）。TΔS是结合构相的熵变，用MacroModel模块的Rigid Rotor Harmonic Oscillator （RRHO）分析计算。ΔG&#39;bind忽略了熵贡献，而ΔGbind包括了配体平移，旋转和振动时的熵损失（TΔS）。
其实以上方法是偏重于对已知结构的受体与配体分子间的作用模式的模拟从而达到预测药物活性等目的，当然也可根据模拟过程中的一系列数据分析对所设计的药物分子的结构进行相应的修饰和改进以使药物与靶点更好地作用......所以只能算是根据靶点蛋白质结构设计药物n种途径中的一种，毕竟咱大锁钥理论博大精深嘛。

队长是我 · 发表于 2025-5-27 22:02

这个貌似是真正本行的问题，试着答一下，一定不全面，求批评指正。
先介绍一下背景，我本科在国内学的是数学，因为这一方面我是到美帝以后才接触的，所以许多专有名词我都不知道对应中文翻译，看前面答案了解了一些，尽量中英对照力求准确，实在不知道的我还是用英文吧。PhD在现在这个组，我们组是个纯计算组，做的是结构生物学，我们专攻方向是小分子抑制剂开发，以及相关对接（docking，看之前回答应该是翻译成对接吧）软件的开发，所以在相关方面还是有一定了解。
对接软件
看到之前回答的朋友们提到的分子对接软件都是autodock，discovery studio，MOE这些的，我还是有些心痛的，因为我组正是DOCK这个软件现在的主要开发组，DOCK作为世界上第一款模拟分子对接的软件，现在似乎用户相当少，不过我们还是在坚持开发，DOCK6.4到最新的DOCK6.7主要都是由我组开发的，很快应该就会发布DOCK6.8了（并没有人在乎）。之前的几个回答对于分子对接的过程的描述都是相当好的，我就不赘述了，这里从软件层面大概补充一下分子对接模拟的两大流派吧。
为了完成对于一个小分子和一个靶点蛋白质的对接模拟，基本上有两大要素，第一就是小分子本身可能形成的结构，基本上是由分子每一个rotatable bond的二面角（dihedral angle）所决定的，另一点就是小分子和靶点蛋白质之间的相互作用，最基本的就是范德华力和静电作用。我所谓的对接软件两大流派的区别就在于完成这两个要素的过程不尽相同。比方说我们要模拟某一个小分子和某靶点蛋白质的对接，一大流派（如果没记错的话autodock应该就是这样的，但是我不确定，以及DOCK3分支也是这一派的）的思路就是，首先生成这个小分子所有可能的结构，然后试着把这些结构在不改变内部自由度的前提下对接到靶点蛋白质的binding site内，进行一些局部的minimization，寻找到最合适的对接位置，然后用打分函数对于所有的结构打分排序。另一个流派（以DOCK6分支为代表吧）的思路是这样的，我们试图首先把这个小分子按rotatable bond分为若干片段，然后从其中最大的片段（我们成为锚，anchor）开始，首先把这个anchor放到binding site里，计算这个anchor和蛋白质之间的相互作用，进行局部优化，然后按顺序把下一个片段接到anchor上，尝试不同的二面角，计算相互作用，局部优化，然后周而复始，直到在binding site内把这个小分子组装完成为止。从目前看到的数据来看，两种方式在复制晶体结构（把一个小分子和蛋白质complex晶体结构拿来，把小分子拿出来，用软件模拟对接，看软件模拟结果和晶体结构是否相似）的成功率方面不相上下，但是效率似乎是第一种方式更高一些。虽然如此，至少我老板还是执着于第二种方式，因为还有一些更多的应用前景，后面会提到。
打分函数
对于一个对接软件来说，打分函数可以说是最重要的一个部分了，有一个或者多个好的打分函数，可以大大提高虚拟筛选的成功率。打分函数也可以大致分为两大类，一类就是以物理为基础的，比如之前提到的范德华力和静电作用，再有也可以包括类似单点（single point）的MM/GBSA或者MM/PBSA计算，能够包括desolvation penalty，但是由于只有一个结构进行单点计算，所以结果可能不是特别准确，远不如使用分子动力学模拟以后的计算来的准确。另一大类的打分函数是以相似度为基础的，即已知一个具有活性的小分子抑制剂，通过计算一个化合物库内化合物和已知抑制剂之间的相似程度排序，找出其中最接近的分子，也就是理论上最可能具有相似活性的分子了。这里所说的相似可以有许多不同的方面，包括二维分子结构，三维分子结构，在binding site内所占体积相似，药效基团（pharmacophore）结构相似，或者是和靶点蛋白质的相互作用方式相似等等不同的方式比较。据我所知这一类的打分函数在工业界应用得似乎更多一些。当然以相似度作为打分函数最大的问题可能就是，你找到的得分最高的分子理论上是跟已知分子最接近的一个，也就是说很有可能在活性上没有特别大的提升，但是同时，筛选抑制剂，或者说最终制药，活性只是一个方面，还有其他各种标准，所以这样的筛选也是有很大意义的。
虚拟筛选
这块我最熟了，嗯，我们组就是专门做这个的。其实说实话，讲完前面这些以后，虚拟筛选也就没有什么太多可以讲的了，简单说就是用对接软件，去做大量化合物库的对接模拟，当然，现在的化合物库做虚拟筛选一般数量都是以百万计的，挨个做一遍对接，然后打分，排队，买化合物，测活性。讲真木有什么特别的，不过看到前面回答里说拿几百几千个小分子出来做高通的我看着还是很羡慕的，毕竟我组是纯计算组，每次都只能买一百个左右的小分子拿去到合作实验室做活性，不过多少还是能找到几个有活性的分子的╮(╯-╰)╭
缺陷
讲了这么多，还是要来讲一讲现在对接软件最大的缺陷的，第一就是，慢，这个东西其实也没辙，只能这么慢，当然对于我们这些学术软件来说，木有人做软件优化也是一个很大的问题，一代一代的PhD们攒下来的代码，要说没有问题没有bug，那才是见鬼呢。。。。所以软件本身的效率确实存在一定问题，再有就是对接软件天生的不足了，因为要兼顾准确率和效率，所以现在市面上绝大多数对接软件（不包括商业软件，不了解）基本都没有办法很好的在计算对接的同时模拟靶点蛋白质的receptor flexibility，只能使用一个静态的靶点蛋白质结构，由于小分子和靶点蛋白质在对接过程中，事实上两者都在运动，而靶点蛋白在binding site内氨基酸sidechain的移动很有可能让原本看起来不能fit进去的小分子能够很好的和蛋白质产生相互作用，而这一点暂时我们使用对接软件都无法模拟。另一个问题就是我们对接软件内现在所有的打分函数对于小分子的排序都是基于一个静态的结构，导致的结果就是计算结果误差相对比较大，这一点其实和第一点是相关的。这个问题目前来说只能通过分子动力学模拟来解决，但是MD的效率相对来说就太低了，所以只能针对比较少量的分子进行模拟。还有一个问题基本上就是一个永恒的问题，打分函数。现在几乎所有的打分函数都是相当粗糙的，确实我们都看到很多成功的例子，但是进步的空间依然很大。我们现在的一个思路是在开发新的打分函数的同时，能够将各种不同的打分函数进行组合，以期得到最好的效果。
进展/设计
其实之前说了那么多，和题主所问的设计关系并不大╮(╯-╰)╭现在再来讲讲所谓的小分子设计吧，其实这也是对接软件的一个重要的发展方向。
要说小分子的设计，其实也分两类吧，一类是在已知有活性的小分子基础上进行设计，通过改变各种基团，试图提高小分子的活性，而另一类就是完全从头开始设计一个全系的分子，也就是其他回答里提到的de novo design，这两类我都试着稍微说一下吧，毕竟都有接触。
第一类设计一般是在虚拟筛选得到一些有活性的分子以后进行的，一大方式就是SAR模型，这一类研究更多的要依靠实验室合成和测试化合物，大概就是这里添一个基团，那里换一个基团，看看怎样做出来的化合物活性最高，然后总结出一些规律。这种做法的一大好处是，有没有结构都能往下做，有结构自然最好，没有的话问题也不大，凭经验也能分析个八九不离十的。除此以外另一类方式就是以结构为基础的设计（structure-based design）了，我们也喜欢把这个称为rationale design，也就是说我们是看着结构来的，不是靠蒙的（其实还是要靠蒙╮(╯-╰)╭）。从名字就知道，对我们来说结构异常重要，能够有晶体自然是最好的，没有的话就要靠对接软件预测了，预测得到的结构我们一般会用MD进一步验证，主要是看结构是否稳定，同时计算free energy of binding这些东西，然后根据结构来判断在哪些点位上添加哪些基团会得到更好的亲和力，然后就是又一轮新的预测和计算，排序，合成，测试活性，周而复始。
重点来说说另一类设计分子的方式，也就是de novo design吧，我个人认为这将是小分子抑制剂设计的发展方向。简单说，这个概念和虚拟筛选相对，使用的是分子片段，或者基团组成的库，而不是完整的化合物库，针对一个靶点蛋白质的binding site，通过不断地排列组合各种不同的基团，最终设计出一些对于这个蛋白质有比较好理论活性的小分子。这一类方式最大的好处在于不用再受到所使用的化合物库的限制，理论上能够通过不断地排列组合来探索一个极其大，甚至于覆盖整个的chemical space。据我所知，市面上目前还没有一款软件能真正完成这样的功能，我见到过一些软件能做一些类似于通过排列组合生成新的化合物之类的模拟，但是似乎并没有太大的影响力。我组现在对于最新版本DOCK的开发就是针对这个方向，现在代码完成都大概在85%以上了，论文应该也会很快发表吧。。回到之前说的对接软件预测小分子结构的两种方式，我个人认为要应用在de novo design上的话，在binding site内搭建通过一个个片段组装的方式来搭建一个新的分子应该是更行之有效的方式。因为如果说要先做好分子的结构，然后试着fit进binding site，一个很大的问题是这样真的会需要通过排列组合生成所有可能的分子构成和各种不同的结构（conformer），我觉得效率会是一个大问题。但是如果采用在binding site内搭建的方式的话，可以一定程度上避免这个问题，因为有了binding site结构的限制，许多基团在搭建的过程中就可以知道无法fit进去，也就由此减少了很多无谓的尝试。另一方面，整个de novo design的过程，可以由不同的打分函数来指导，以期得到不同性质的结果，比如如果只用分子间作用来指导设计，那么很可能会最终得到一个相对比较大的分子，因为更大的分子能够形成更多的分子间作用力，从而获得更好的分数；而如果用二位分子结构相似度来指导设计的话，就可以期待最终会得到一个和参考分子非常相似的分子。而最终，在我们的理想当中，我们应该用一些列打分函数的组合来指导de novo设计出的分子，以期得到有最好性质的一些分子。同时，de novo design也可以被用来在已知活性的小分子为基础的设计，可以将小分子的全部或者部分保留，以此为基础做设计，这样的话可以完成自动化程度更高的analog design。
de novo design的应用前景看起来非常美好，但现阶段还是有一些非常大的挑战的。其一就是效率，这个挑战是必然存在的，要覆盖更大的chemical diversity，必然花费相对更多的时间。另一点就是如何设计出更合理，更现实，能够被合成的分子。因为我木有任何化学和有机化学的背景，当初刚开始是试着设计分子往上加基团的时候，往往是看上去很美，但是老板拿着我设计的分子，第一句话一般是，你去给我查查，你设计的这玩意儿真的有可能存在么╮(╯-╰)╭所以，让电脑设计出有可能被合成的分子当然也是一个很大的挑战了。

好了，拉拉杂杂说了那么多，基本就是我在这个领域内一些了解和认识了，欢迎讨论，欢迎指正。谢谢大家。

长长的路 · 发表于 2025-5-27 22:03

我在美帝大农村某一大学城读药学phd，稍微补充一点点。之前的答案里已经提到从头设计（de novo design），基于片段的设计（fragment based design）以及虚筛。我了解得最多的是基于靶点结构的计算机辅助虚拟筛选（structure based virtual screening）。
@观鱼对这个过程已经说的比较具体，我想题主说的靶点大概指晶体结构被报道了的蛋白吧（当然其他生物大分子DNA，RNA也是能做靶点的）。一般我们会选择蛋白的活性位点做虚筛对象，比如说我们做酶抑制剂的，会优先选择把靶点结构中参与酶反应的那一小块选做对接虚筛。虚筛可以把小分子化合物库（大概几十万个化合物）中最有可能和靶点结合的小分子选择出来排个序（大概几百几千个化合物）。接下来这些小分子会被用作高通量生化活性筛选（high throughput buochemical screening），比方说我们组是做单浓度（10 uM）的enzyme activity inhibition assay，有的也直接上细胞筛的，一般都是在384或96孔板里，根据靶点本身的特点和所筛化合物的特性选择assay。虚筛的结果和生物活性不一定是一致的，要以生物活性为准。这一步下来又能排除很多化合物，大概留下几十上百个活性好的，排除那些非特异性结合和假阳性结果，剩下的那一批几十个化合物会做进一步的分析，比如测它们的IC50（抑制50%蛋白活性时的小分子药物的浓度）和Ki（binding affinity，小分子药物与靶标的结合常数）等。再有了小范围的化合物以后，我们就能用药物化学的方法做构效关系分析（structure activity relation ship analysis）。在这一步里我们又能回到靶点结构中，通过docking和molecular dynamics模拟相互作用，找到靶点/结合位点中的重要氨基酸残基，相对应的在小分子上做有针对性的结构改造（比如模拟结果中小分子的某一部分处在蛋白结合位点的疏水区，那我们就把小分子上的那一部分改造得更疏水，从而加强与蛋白的相互作用，降低Ki和IC50。当然我们更希望拿到药物和靶标的共晶体啦，这样drug-target interaction就一目了然啦，而且会对化学改造更有信心，然而，晶体实在是可遇不可求，所以这种计算机辅助药物设计是个很好的代替。
另外一条思路是，如果题主能查到报道过的能和蛋白靶点结合的化合物，可以以此为模板用基于药物的虚筛（ligand based virtual screening）找到更多结构相似（但不一定是衍生物）的化合物，来做活性测试和构效关系分析。其实这里也可以用到基于药效团/药效片段的虚筛，也就是把已知的药物的结构打散成几段fragment，或者已知药物已经有结构改造和构效关系分析数据，那么通过计算机辅助我们就能找到其中的药效基团（pharmacophore），根据这些信息来做虚筛。
总的来说，初期药物研发的目标是找到活性更强的化合物，而知道靶点结构，利用药物和靶点结合位点的性质能帮助我们更好地达到这个目标。其中用到蛋白靶点结构的时候有：一，基于靶点结构的虚筛的时候用；二，研究药效关系时改进药物结构用（可能还有第三，做共结晶的时候拿来当作数据解析的参考）。
我们实验室拿来分析结构和做对接的软件就是discovery studio。老板当时买的时候花了两万多刀，不过软件确实很适合做药物化学而不是做计算化学的人用，界面友好操作相对傻瓜，不需要深入了解量子化学理论那些的就能用。实验室也有博后之前用过MOE，表示界面友好容易上手，但计算功能没有discovery studio强大。
除了传统的小分子药物以外，免疫疗法和多肽类药物这些年来也是发展得很迅猛。多肽类的药物很多是靠破坏蛋白-蛋白相互作用达到阻断信号通路或者抑制酶活性的效果，也有与蛋白类底物竞争来抑制活性的。由于大分子的结构相对复杂，很少听说有用虚拟筛选来做的。通常多肽类抑制剂都是底物的类似物（substrate analog，比如我们一直蛋白100号位点的赖氨酸Lys100能被乙酰化，那我们就选取这个蛋白序列上赖氨酸附近的氨基酸做一条含有5-20个氨基酸的多肽，并将底物氨基酸做替换或修饰避免酶反应发生，这样这条多肽能保持和靶标蛋白的结合能力，从而与原本的底物竞争来抑制酶反应；又或者如果蛋白A和蛋白B结合以后才有活性，那么针对A和B的结合位点，在B上选择与A结合的一段蛋白序列做成多肽b，多肽b能与A结合从而与蛋白B竞争等等）。免疫疗法就是指针对靶标做出抗体，但通常情况下该靶标必须在细胞表面抗体才能识别。这些抗体除了从动物血清中提取，也能对上面的多糖做针对性的化学修饰从而提高结合/识别能力的(对这个领域并不是特别了解，从某次seminar听来的，暂时没找到文献)。
参考文献：
Young, David C. Computational drug design: a guide for computational and medicinal chemists. John Wiley & Sons, 2009. (正在读的计算机辅助药物设计入门书)
Sliwoski, Gregory, et al. &#34;Computational methods in drug discovery.&#34;Pharmacological reviews 66.1 (2014): 334-395.
Craik, David J., et al. &#34;The future of peptide‐based drugs.&#34; Chemical biology & drug design 81.1 (2013): 136-147.
以上回答只是我个人对这个方向粗浅的理解，如果需要以后可以补上参考文献。另外，知乎上有一些关于药物研发分那些阶段的问题都有很详尽的回答，这里就不再重复了。
(￣^￣)ゞ

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