分子生物学荧光定量PCR实验中会遇到哪些问题？

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分子生物学荧光定量PCR实验中会遇到哪些问题？
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长长的路

qPCR从样本采集到结果检出有很多的步骤，包括样本采集、样本保存、样本处理、样本检测、数据分析等一系列环节，不同的环节可以选择不同的对照进行监测，对照总体可分为阴性对照与阳性对照两类：
阴性对照

实验中经常遇到无法判断反应孔中的扩增信号是样本真实扩增还是污染扩增的情况，这就需要阴性对照来作为对比。常见的阴性对照有以下几种：
●  无模板阴性对照(No Template Control, NTC)

NTC一般用纯化水代替，用以替代正常反应中的核酸样本，来监测反应体系中的污染情况。正常情况下，NTC样本不应扩增出信号，如果出现NTC孔扩增的情况，即预示反应体系可能存在污染。
●  无逆转录酶对照(No Reverse-Transcriptase Control，No RT)

No RT是指在进行逆转录实验中不加入逆转录酶，经过此过程的cDNA在后续qPCR过程中出现了荧光信号，则代表样本中含有未去除干净的基因组DNA。
●  阴性样本对照(Negative Sample Control, NSC)

NSC是指不含目的基因的样本，在经过前处理后进行qPCR扩增，如出现扩增信号，应结合NTC结果，分析是否处理过程中污染了阳性样本。
阳性对照

qPCR实验结束后，如反应孔出现无扩增或扩增Ct值很大的情况，在无法确认目的基因是否正常扩增时，阳性对照的正确选择可以避免错误的报告情况。
●  扩增对照(Amplification Control)

使用含有目的基因的质粒、假病毒或其基因组DNA作为扩增对照，监测PCR扩增体系是否正常。如出现Ct值偏差较大或无扩增，则表示反应体系存在问题。
●  阳性样本对照(Positive Sample Control, PCS)

通过对确认的样本阳性进行独立的提取操作，并完成后续PCR过程，以最终结果来判断实验方法的可靠性。
●  内部阳性对照(Internal Positive Control，IPC)

一般在核酸提取前向样本中加入定量的外源性核酸，最终以多重反应体系同时扩增目的片段与该外源基因，通过Ct值判断提取过程中的核酸回收效率。
●  内参基因(Endogenous Control)

往往是各组织和细胞中表达相对恒定的基因，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常见的内参基因有GAPDH、β- actin、18sRNA、28sRNA、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP等。参基因的选择可参考已发表文献或通过具体实验来筛选；也可通过内参基因数据库来检索，如中科院内参基因数据库（ICG http://icg.big.ac.cn/），里面涵盖了200多个物种的内参基因信息。
以上就是qPCR实验中常用的对照，灵活运用能够大大提高实验的效率，及时找出和分析实验失败的原因。
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检验医师

1  样品 RNA 的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。
②两相分离 每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈 振荡管体 15 秒后，15 到 30℃孵育 2 到 3 分钟。4℃下 12000rpm 离心 15 分钟。离心后 混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相 中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。
③RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀 其中的 RNA，混匀后 15 到 30℃孵育 10 分钟后，于 4℃下 12000rpm 离心 10 分钟。此 时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA 清洗  移去上清液，每  1mlTRIZOL  试剂裂解的样品中加入至少 1ml  的 75%乙醇（75%乙醇用 DEPCH2O 配制），清洗 RNA 沉淀。混匀后，4℃下 7000rpm 离心 5 分钟。
⑤RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。
⑥溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40μl 用枪反复吹打几次，使其完 全溶解，获得的 RNA 溶液保存于-80℃待用。
2 RNA 质量检测
1）紫外吸收法测定
先用稀释用的 TE 溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释（1:100）后， 读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的吸收值，测定 RNA 溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260 下读值为 1 表示 40 µg RNA/ml。样品 RNA 浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。具体计算如下：
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84  µg/µl取 5ul 用来测量以后，剩余样品 RNA 为 35 µl，剩余 RNA 总量为： 35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg
②纯度检测
RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8 到 2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g 琼脂糖溶于 72ml 水中，冷却至 60℃，10 ml 的 10× MOPS 电泳缓冲液和 18 ml 的 37%
甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS 电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M  MOPS，pH 7.0
0.1M  乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25 µl 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽 内，加足量的 1×MOPS 电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备 RNA 样品
取 3µgRNA，加 3 倍体积的甲醛上样染液，加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为 10µg/ml。 加热至 70℃孵育 15 分钟使样品变性。


③电泳
上样前凝胶须预电泳 5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm 电压下 2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少 2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类型），上 面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由 低分子量的 RNA（tRNA 和 5S 核糖体 RNA）组成。在 18S 和 28S 核糖体带之间可以看到 一片弥散的 EB 染色物质，可能是由 mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果 出现 DNA 污染，将会在 28S 核糖体 RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或 者带，RNA 的降解表现为核糖体 RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
3 样品 cDNA 合成
①反应体系
序号 反应物 剂量
1  逆转录 buffer 2μl
2  上游引物  0.2μl
3  下游引物  0.2μl
4  dNTP 0.1μl
5  逆转录酶 MMLV 0.5μl
6 DEPC 水 5μl
7 RNA 模版 2μl
8  总体积  10μl
②混合液在加入逆转录酶 MMLV  之前先 70℃干浴 3 分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶 0.5μl，37℃水浴 60 分钟。
轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。
③取出后立即 95℃干浴 3 分钟，得到逆转录终溶液即为 cDNA 溶液，保存于-80℃待用。
4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量 PCR
①β-actin 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为 1011，反应前取 3μl 按 10 倍稀释（加水 27μl 并充分混匀）为 1010，依次稀释至 109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系 序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1  染料 10μl
2 2  阳性模板上游引物 F 0.5μl
3 3  阳性模板下游引物 R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq 酶 1μl
6 阳性模板 DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。
管家基因反应体系：
序号 反应物 剂量
1  SYBR Green 1  染料 10μl
2  内参照上游引物 F 0.5μl
3  内参照下游引物 R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5 Taq 酶 1μl
6 待测样品 cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2 分钟，然后 93℃  1 分钟，55℃ 2 分钟，共 40 个循环。
5  制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA 模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的 cDNA 模板进行 PCR 反应。
反应体系：
序号 反应物 剂量
1  10× PCR 缓冲液  2.5 ul
2  MgCl2  溶液  1.5 ul
3  上游引物 F  0.5 ul
4  下游引物 R  0.5 ul
5 dNTP 混合液 3 ul
6 Taq 聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8  加水至总体积为 25ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。
35 个 PCR 循环（94℃1 分钟；55℃1 分钟；72℃1 分钟）；  72ºC 延伸 5 分钟。
②PCR 产物与  DNA  Ladder 在 2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。
③将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释: 将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释: 设定 PCR 产物浓度 为 1×1010，依次稀释至 109、108、107、106、105、104 几个浓度梯度。
6  待测样品的待测基因实时定量 PCR
①所有 cDNA 样品分别配置实时定量 PCR 反应体系。 体系配置如下：
序号 反应物 剂量
1  SYBR Green 1 染料 10 ul
2  上游引物 1ul
3  下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq 聚合酶 2ul
6 待测样品 cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。
②将配制好的 PCR 反应溶液置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR 扩增反应。反应条件为：93℃2 分钟预变性，然后按 93℃  1 分钟，55℃1 分钟，72℃1 分钟，共 40 做个循环，最后 72℃7 分钟延伸。
7  实时定量 PCR 使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发 DNA  聚合反应(即错配)。
8 电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行 Realtime PCR 反应。PCR 产物与 DNA Ladder 在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。



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卡卡

实时定量PCR技术（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。目前仍在全球肆虐的新型冠状病毒鉴定的“金标准”——核酸检测就是通过qPCR原理进行的。

那么拿到一个样本，需要经过以下多项操作流程才能定量检测到它的核酸含量。其中任何一个步骤操作失误都会导致它的检测结果出现异常！
PCR仪器-荧光定量PCR仪-PCR仪价格-苏州阿尔法生物实验器材有限公司1、无Ct值出现
a) 检测荧光信号的步骤有误：一般染料法采用72℃延伸时采集，探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
b) 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。
c) 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
d) 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
e) 反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号。

2、Ct值出现过晚
a) 扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。
b) 模板浓度太低：减少稀释度，重复实验。
c) 模板降解：重新制备模板，重复实验。
d) PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-200 bp之间。
e) 反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，导致模板质量不高，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

3、阴性对照出现明显扩增
a) 反应体系组分（如水）被污染：实验过程中，更换新的Mix或者水重复实验。
b) 标本间的交叉污染或产物污染：反应体系在超净工作台内配制，对实验室进行严格的区分，减少气溶胶污染；使用带滤芯的枪头。
c) 引物二聚体的出现：引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
d) 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。

4、熔解曲线出现多峰
a) 非特异性扩增。
b) 引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现。
c) 引物浓度不佳：适当调整引物浓度。
d) 退火温度低：提高退火温度。
e) 模板中有基因组DNA的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的污染（DNaseI处理），或通过设计引物避免非特异性扩增。

5、出现引物二聚体
a) 优化扩增条件，如提高退火温度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤)有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为60°C。
b) 引物浓度太高，适当降低引物浓度。
c) 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100 bp以下。

6、扩增效率低
a) 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
b) 反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法。
c) 反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。

7、实验重复性差
a) 加样体积失准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。
b) 定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
c) 模板浓度太低：模板浓度越稀，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
d) qPCR mix没有完全混匀，请使用前充分混匀。
苏州阿尔法生物提供的PCR仪系列主要有A100基因扩增仪、A200PCR仪、A300快速PCR仪、A600梯度PCR仪、T20PCR仪、Q2000B高通量荧光定量PCR仪、便携式PCR仪等

队长是我

PCR是生物领域中最基础，也是尤为重要的一环
今天给大家讲述一些
PCR应该了解的知识 与 实验出现问题的解决办法
首先给大家详细介绍下其原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）原理：
即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。



介绍了原理，少不了得说其几个重要体系成份：
1.模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA、也可以是细菌、组织样品等。
2.引物（Primer）：确定扩增目的序列打的特异性；确定扩增引物长度。
3.DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的机器。
4.缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。
5.脱氧核苷酸（dNTP）:DNA的基本组成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。
6.Mg、K离子增强剂。

而我们在PCR实际操作过程中会遇到很多不可避免的问题，比如说：PCR产物条带拖尾，有杂带，更严重的是除了marker外，啥条带都看不到。






那我们应该如何有效的避免出现这些问题呢？
首先得找出出现这些问题的原因，才能有效解决问题。
常见的问题有很多种，但绝大部分能总结出以下几点。
问题一：完全没有条带
1.确认试剂是否存在质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。
2.检查模板DNA是否正确或者存在特殊结构，导致模板与引物无法结合。
3.引物或反应温度设计不合理。

问题二：有很多非特异性条带
1.反应体系被污染。
2.引物特异性差。
3.退火温度不合适。

问题三：目的条带弱
1.聚合酶活性过低。
2.循环次数偏低。
3.模板DNA浓度过低。

问题四：PCR产物出现片状拖尾
1.DNA聚合酶过多或酶活性差。
2.dNTP和Mg离子浓度过高。
3.退火温度过低，PCR循环数偏多。
4.模板DNA用量过大或模板DNA不纯。
5.引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特异性扩增。

知道了问题的出现原因，就能有效的针对并改变PCR条件，跑出漂亮的条带了。最后祝大家，PCR每次都能成功扩出目的条带。

卡卡

1 做荧光定量PCR之前，考虑到的是你能接触到什么机型的PCR仪，不同的PCR仪兼容的耗材以及试剂不一样的，如果你没有别人带，自己第一次做，一定要注意。
2 做荧光定量PCR最重要的莫过于，引物和模板的准备。提取RNA之后一定要电泳检测其降解状态，如果发生了降解很容易导致结果偏差；引物设计的好坏直接关系着后续实验的成功，所以引物合成回来，可以做个普通的pcr，跑电泳验证其特异性。如果同时要检测很多的基因，那么设计的时候，引物的Tm最好都相近在60度左右，扩增产物150bp左右最好，有利于操作。
3 荧光定量PCR的体系确定，大的体系容错率可能稍微高一点，小的体系对操作的精度和准度要求比较高，但是可以很好的的节省cDNA模板。如果没有电动的分液枪，要熟练的使用普通移液器。
4 进行具体实验之前，要测定引物的扩增效率，通常来说，比较两种处理中基因表达的差异是需要内参基因的，这样的比较，是假定兴趣基因引物以及内参基因的扩增效率相同且为1的。如果引物太多，可以看荧光定量PCR的扩增曲线，如果形态相近的话，一般也认为扩增效率是一致的。
5 荧光定量PCR最少设置三个技术性重复组，同时一定要有空白对照组，有很多人没有这种习惯，其实很危险。
6 荧光定量PCR的程序和普通PCR不同，会多一个melting的部分，同时三步循环中延伸的部分可以去掉，节省时间。
7 荧光定量PCR结束之后要去看下溶解度曲线，每种扩增产物的曲线为单峰既Ok
8 数据的处理，这部分首先要根据sd值判断数据质量。如果重复组数据波动很大，则会导致结果不可信，当然如果设置的重复组较多，有些明显的单个异常值可以去掉，优化数据。最后需要根据不同的目的来对数据进行不同的计算处理。