做western blot时，蛋白转到膜上了，但是marker看不到，为什么marker没转上呢？

会里很

western blot看到了目的条带，但是看不到marker，为什么marker没转上呢，这样目的蛋白的结果有说服力吗？可以用吗？？



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同花顺

蛋白质预染marker的应用非常广泛。在分子生物学研究中，它可以用于检测蛋白质的表达、鉴定蛋白质的分子量和进行蛋白质的半定量分析。常应用于凝胶电泳和蛋白质印记，蛋白质阶梯以即用型形式提供，可直接加载到凝胶或NC膜上。
所有预染蛋白Marker的表观分子量都会因缓冲条件的不同而发生变化，所以应根据所用凝胶体系使用相匹配的表观分子量，来更准确地定位您的目标蛋白。根据蛋白Maker说明书中的迁移模式示意图，则可知道Marker在各凝胶体系中的表观分子量。


SDS-PAGE凝胶电泳通过将混合的蛋白质样品注入到已凝固的聚丙烯酰胺凝胶中，然后通过电场使蛋白质在凝胶中迁移，从而将其分离出来。 PAGE凝胶的孔隙大小可以调整，在SDS-PAGE中，蛋白质被丙烯酰胺基团偶联的十二烷基硫酸钠(SDS)包裹，使得蛋白质带有负电荷。
通过调整凝胶的孔隙大小和运行条件，可以实现不同大小的蛋白质的分离。较小的蛋白质能够快速通过凝胶的孔隙，而较大的蛋白质则迁移速度较慢。因此，通过PAGE凝胶电泳，可以实现对不同蛋白质大小的分离。需要注意的是，当处理较大的蛋白质复合物或聚合物时，PAGE凝胶电泳的效果可能受到限制。在这种情况下，可以考虑使用其他分离技术，如凝胶过滤、凝胶渗透色谱等。不同分子量大小的蛋白质需要用不同浓度的SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。


Western blot中转膜是一种将PAGE凝胶中分离的蛋白质转移到膜上的技术，以便进一步检测和分析蛋白质。对于新手来说，转膜的过程并不是一帆风顺的，甚至是一个相当痛苦的经历。初次接触这个过程时不会料到会有这么多复杂的步骤和麻烦。要找到可靠的WB转膜条件，需要耗费不少时间和精力。其中会遇到一些技术细节问题，实验中一定一定牢记一条：细节决定成败。在转膜中，师兄准备了一份根据蛋白质分子量的不同大小对应转膜时间的小总结。总而言之，Western blot转膜对于每一位科研工作者都是一个具有挑战性的过程。

队长是我

Western blotting 用于检测和检查不同样品设置中细胞类型中存在的感兴趣蛋白质的丰度。它还可用于检测蛋白质中的翻译后修饰(PTM)。蛋白免疫印迹技术已广泛用于研究蛋白激酶的信号传导。该技术涉及在电泳仪中使用变性聚丙烯酰胺凝胶从细胞提取物中分离蛋白质。蛋白质在电场的影响下被分离，基于它们在凝胶中作为不同条带的分子量。分离后，蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 或硝化纤维素上膜作进一步处理。转移后，结合蛋白质的膜用封闭溶液处理以减少非特异性信号。然后用洗涤缓冲液洗涤膜，然后与对感兴趣的蛋白质具有特异性的一抗孵育。一抗可直接偶联辣根过氧化物酶(HRP) 或其他报告模块进行检测。然而，大多数协议使用对一抗特异的二抗 HRP 偶联抗体，并使用化学发光成像平台进行可视化。





Western blotting



Western blotting
蛋白免疫印迹技术中信号的特异性取决于所使用的抗体，因此提高特异性抗体的更好方法转化为更好的结果。大多数参与信号传导的激酶将磷酸基团添加到底物的 Ser 和 Thr 残基中。添加一个额外的基团会增加底物或下游靶标的分子量，这可以在蛋白质印迹中检测到。然而，特定的多克隆或单克隆抗体. 然而，针对底物的特异性多克隆或单克隆抗体无法区分蛋白质的磷酸化和非磷酸化状态。相反，针对磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基的抗体可用于检测蛋白质的活化状态。然而，这些抗体会检测所有磷酸化的含 Ser 和 Thr 的蛋白质，因此不会提供太多特异性。丝氨酸和苏氨酸残基可用于检测蛋白质的活化状态。然而，这些抗体会检测所有磷酸化的含 Ser 和 Thr 的蛋白质，因此不会提供太多特异性。




western blot

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开发用于检测磷酸化蛋白质的更特异性抗体的另一种方法涉及在磷酸化丝氨酸或苏氨酸周围包含氨基酸残基，从而产生可以产生高度特异性抗体的短肽。针对此类含有翻译后修饰的短肽产生的抗体提供了仅检测活化形式蛋白质的机会，因此，通过适当的控制，有助于在蛋白质印迹和其他实验技术中研究信号蛋白。
为了使蛋白质条带可视化，与HRP偶联的二抗是常用的。这些抗体会与一抗结合，并通过化学发光帮助检测和捕获蛋白质条带。K. Hensley 等人早在 2000 年时进行的一项研究中发现了使用磷酸化特异性抗体研究细胞信号通路的方法，他们表明外源性 H 诱导的氧化应激Western blotting 和随后的技术，例如免疫沉淀和 pull-down 检测，通常一起用于研究信号通路中涉及的蛋白质。一抗或二抗也可以与荧光团共价连接。检测此类印迹中的条带是通过捕获抗体偶联荧光团发出的荧光而不是生化反应来完成的。




蛋白免疫印迹技术


    与传统的蛋白质印迹相比，荧光蛋白质印迹具有多项优势。主要优点之一是能够通过多重检测同一印迹中的不同蛋白质，其中两个或多个与不同荧光团偶联的二抗可以定向到它们各自对不同蛋白质具有特异性的一抗。
   蛋白质印迹的另一个应用是检测裂解的蛋白质，如半胱天冬酶，它们经过酶促裂解以激活。可以生成对裂解蛋白质特异的抗体，它们靶向仅在裂解后暴露的不同氨基。因此，这些抗体可用于仅检测活化的蛋白质对应物，从而提供更好的特异性和更多信息。
来源：苏州阿尔法生物

同花顺

相比于学基础医院或者生物科学的同学，实验操作是临床同学心中的痛，而Western blot(蛋白免疫印迹)作为科研研究中最为平常而且应用最广的基础实验方法，更是让人痛上加痛。做过WB的同学，必然会被虐的体无完肤过，甚至有的人开始怀疑人生。没有做过的同学，也不得不学习这个方法，基本很难绕过去，今天跟大家介绍下让人既爱又恨的WB。

一、 什么是WB？

百度告诉我们：蛋白免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

二、 WB的实验原理是什么？

Western Blot法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质作为检测物，以抗体作为“探针”，通过标记的二抗“显色”后检测灰度值判断样本中某种蛋白含量的多少。简单说就是，想要检测样本中某种蛋白是否存在或者其含量多少，以蛋白作为抗原，使用特异性一抗结合抗原后，再使用二抗结合一抗并放大，再经过显色的方法进行检测。

再具体一点来讲的话，首先经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分及蛋白水平的表达。

三、 WB的实验步骤：

1.蛋白样品制备（细胞或者组织中总蛋白的提取及定量）

提取蛋白：使用蛋白裂解液裂解组织或者细胞（组织需要研磨成匀浆后再进行后续处理），释放目的蛋白。

蛋白质含量的测定:确保每个蛋白样品上样量一致，常用BCA法、考马斯亮蓝法等

2. 电泳

   电泳采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，意义在于分离不同分子量的蛋白，是Western blot的核心技术之一。因为蛋白质带有负电荷，电泳时可以从负极到正极移动，大分子量的蛋白移动速度慢，小分子量的蛋白移动速度快，因而可以将不同分子量的蛋白分开。一般随着凝胶浓度的不同，线性分离的范围也不同。

第一步：清洗玻璃板，干净的玻璃板是基本要求；

第二步：配胶，现在有各种各样的可供选择；

第三步：上样，加样不可太快，不然会使样品冲出，若有气泡也可能使样品溢出；

第四步：电泳，浓缩胶70V跑至分离胶接触面，可多跑几分钟；分离胶120-200V电压跑至底端；

第四步：停止电泳。


3. 转膜

    转膜可以说是WB成败的关键，用于Western blot的杂交膜主要有两种：NC膜和PVDF膜，可依据目的蛋白与膜的结合能力及膜的孔径来挑选不同的转移膜。一般转膜电流在200mA-400mA之间，时间为0.5-1小时。也有实验在15-20mA转膜过夜。其中蛋白分子量大于50KD可以使用350mA转膜,分子量小可以适当调低电流，但是具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

第一步：电泳结束的胶进行裁剪，切去浓缩胶；

第二步：剪PVDF或NC膜，PVDF膜需要用甲醇中泡30s激活；

第三步：将膜、海绵、滤纸一起泡入转膜液中保存；

第四步：打开转膜夹，白色在下面，垫上海绵垫，赶走气泡，再垫2层滤纸，赶去其中的气泡。将膜盖于滤纸上，赶去气泡。将胶盖于膜上，赶走气泡。在胶上盖2层滤纸并赶走气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。（注意口诀：黑胶白膜）

第五步：转膜夹置于转膜槽中，黑对黑,红对红，在转膜槽外放冰盒，在冰水混合物中进行转膜。

4. 免疫印记

第一步：转膜完成后，加入封闭液封闭；

第二步：回收封闭液,加入一抗,摇床4℃过夜；

第三步：回收一抗，洗涤液洗涤后与特定浓度的二抗进行孵育结合；

第四步：二抗回收，洗涤液洗涤；

第五步：化学发光显影。

5. 结果定量分析

WB做完后，往往需要对结果进行定量，常用的图像处理软件ImageJ可以很方便的进行灰度和密度分析。

后面可以跟大家继续介绍WB实验中的坑与避坑方法。最后附上B站上的WB操作讲解视频可供参考学习：https://www.bilibili.com/video/BV1hK41157L5?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=766b8bd73ccf9214512defc313e01258

https://www.bilibili.com/video/BV16C4y1a7bd?spm_id_from=333.337.search-card.all.click&vd_source=766b8bd73ccf9214512defc313e01258

感恩由您

marker应该在转完膜孵育抗体之前就可以看到是否成功转至膜上了。在显影时，如果用的是带有CCD相机的仪器读取结果，目的条带读取化学发光信号，而marker要用明场单独拍摄；如果是采用压片，显影定影，则需要提前标记。希望对你有帮助！

队长是我

你这是显影结果吧。marker不被特异性抗体识别，当然不显影来啊，一般是提前用油笔或者铅笔在pvdf膜上标记好marker位置再孵育抗体。