单壁碳纳米管（SWCNT）近年来在光学传感领域受到广泛关注，它们具有近红外发光特性。相比可见光，近红外发光在生物样本中通常具有更低背景、更深穿透和更适合体内应用的优势，因此非常适合发展生物检测甚至植入式传感器。不仅如此，不同手性结构和管径的SWCNT会发出不同波长的窄带光信号，因此可以利用不同手性的纳米管对应不同分析物进行多重检测。但商业SWCNT通常是多手性混合物，不同手性发射峰彼此重叠，严重限制了多重检测能力。虽然已经有多种SWCNT分离方法，包括密度梯度离心、凝胶色谱、离子交换色谱和ATPE等，但后续还需要兼容抗体偶联，并没有真正大规模使用。 近日，来自纽约市立学院的研究团队在杂志Communications Materials上发表了一篇题为 “Antibody-conjugated species-sorted single-walled carbon nanotubes for multiplexed cytokine sensing”的文章，作者证明了带伯胺修饰的ssDNA不仅可以参与SWCNT双水相萃取（ATPE）手性分离，而且分离后还能直接用于碳二亚胺化学偶联抗体。这种方法可成功构建具有明确发射峰并且可并行工作的多重细胞因子传感器。通过此方法，作者成功构建了两种近红外纳米传感器，可在同一体系中实现对IL-12和IL-6的双重检测，不仅如此，还表现出更好的稳定性和重复性。
图片来源：Communications Materials 主要内容 带氨基的ssDNA可用于ATPE分离，并还能直接用于后续抗体偶联 已知ss65是一种能够特异性识别并结合特定手性SWCNT的DNA序列，作者测试了它的氨基化版本ss65-NH₂是否同样可以富集SWCNT。结果表明，ss65-NH₂虽然分离行为发生了变化，但仍然能够实现(6,5)的富集。推测伯胺会改变DNA链的亲水性和整体溶剂化特征，氨基化后的DNA使SWCNT更倾向于停留在更亲水的底相。 这种策略并不只适用于一个手性。作者还进一步证明，ss65-NH₂可在SG76原料中富集了(7,5)，又用ss76-NH₂在另一体系中富集了(7,6)。这是首次证明化学修饰的DNA可用于ATPE手性分离SWCNT，这样做的优势是可以直接和后续的化学偶联设计衔接起来。
使用ss65-NH2进行ATPE分离。图片来源：Communications Materials 抗体偶联纳米传感器的光学特性研究 作者最终选择了高产率、且关键发射峰彼此不重叠的两个样本(6,5)-rich和(7,6)-rich样本。作者下一步直接进行了碳二亚胺交联抗体偶联，把抗IL-12抗体偶联到(6,5)-rich SWCNT上，得到IL-12 Ab-(6,5)，把 抗IL-6抗体偶联到(7,6)-rich SWCNT上，得到IL-6 Ab-(7,6)。结果显示，两种抗体偶联后的SWCNT在近红外区仍保留清晰的发射峰，即使混合后信号也可以清楚分开（图A）。动态光散射和电泳光散射结果显示，偶联后颗粒的粒径增加、ζ电位发生变化，表明SWCNT已成功连接了抗体。 AFM结果显示，偶联抗体后的SWCNT横截面高度明显增加，沿纳米管纵向的高度波动也明显增大，说明表面出现了离散分布的蛋白性突起，达到了每100 nm SWCNT上约2–3个抗体的修饰密度。
抗体偶联纳米传感器的光学特性研究。图片来源：Communications Materials 抗体偶联纳米传感器的多重检测 作者先分别单独测试两种传感器的性能。结果显示，IL-12 Ab-(6,5)在暴露于5μg/mL IL-12 3小时后，平均产生1.76 nm的红移。 IL-6 Ab-(7,6)在暴露于5 μg/mL IL-6后，平均产生2.62nm的红移。 两种传感器混在同一体系中，结果显示，当样本中只有 IL-12 时，主要是(6,5)发射峰红移，而(7,6)基本不变。 当样本中只有IL-6时，主要是(7,6)发射峰红移，而(6,5)基本不变。当样本中同时含有IL-12 和 IL-6时，两个发射峰都发生红移（如下图）。
利用手性分选的传感器进行多重检测。图片来源：Communications Materials 多重检测的特异性和灵敏度测试 作者使用IL-1β和TNF-α测试了系统的特异性。结果显示，不论是(6,5)还是(7,6)通道，对这些非靶标都没有显著红移响应（图A和B）。作者还测试了系统的灵敏度。结果显示，系统对IL-12和IL-6的LOD可低至15 pg/mL。检测范围在具有临床意义的区间内。 不仅如此，作者还测试了未分离的多手性SWCNT作为对比，结果显示手性纯化后的传感器背景更稳定、重复性更好，信号解释也更直接。这表明SWCNT手性分离可以提升光学传感性能。
多重检测的特异性和灵敏度测试。图片来源：Communications Materials
总结与讨论 这项研究提出了一条SWCNT多重生物传感路线。先用ATPE对带氨基修饰DNA包覆的SWCNT进行手性分离，再将分离后的不同手性纳米管分别偶联不同抗体，从而构建具有离散发射峰和特异性的多重近红外传感器，这种方法可用于多重细胞因子检测。 这种方法不仅适用于IL-6和IL-12，而更像一个通用平台。因为只要能够找到合适的DNA序列实现目标手性富集，并且有可用的商业抗体，就可以把不同手性的SWCNT分别功能化为不同生物标志物传感器。已有高光谱显微研究可在单纳米管空间分辨率下区分17种不同手性，这意味着未来可能可以同时检测更多分析物。但这篇文章还只在缓冲液中进行检测，真正走向复杂生物环境时，还需要进一步检验这些传感器在复杂基质中的特异性、稳定性和抗干扰能力。
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