几种同时检测DNA突变和甲基化的NGS策略

2025-8-25 10:33| 编辑: 归去来兮| 查看: 142| 评论: 0|来源: DNA甲基化博览

摘要: 以下是汇总的几个突变和甲基化同时检测的方法，非常值得借鉴。

临床样本的珍贵性再怎么强调都不为过，样本既要做病理检测，又要做分子检测，而且不同类型的分子检测平台有时没法使用同一份样本，导至很多样本只能做一种检测，极大地限制了疾病的治疗和科研的探索。比如在肿瘤研究中，穿刺样本和液体样本能够获取的DNA/RNA非常有限，而单一维度（如突变）的分子检测无法满足临床需求，为了解决样本不足的问题，要么更新检测技术，使用更少量的投入样本量，要么使用同一份样本进行多维度标志物检测。

突变作为经典标志物是很多疾病的必检项，而甲基化作为新型的重要标志物也越来越重要，两者的同时检测不仅是科研还是临床都很有必要。以下是汇总的几个突变和甲基化同时检测的方法，非常值得借鉴。

文献汇总：

Year	Journal	Title
2022	Nature Biotechnology	Simultaneous sequencing of genetic and epigenetic bases in DNA
2022	Science translational medicine	Simultaneous analysis of mutations and methylations in circulating cell-free DNA for hepatocellular carcinoma detection
2022	Genome Research	Methyl-SNP-seq reveals dual readouts of methylome and variome at molecule resolution while enabling target enrichment
2023	PNAS	Detection of rare mutations, copy number alterations, and methylation in the same template DNA molecules
2025	EMBO Molecular Medicine	A DNA alteration and methylation co-detection method for clinical purpose
2025	Nucleic Acids Research	Methyl-CODEC enables simultaneous methylation and duplex sequencing

注：具体实验细节见上述文献

一、Five-letter seq

这个方法很有创新性。方法的核心是利用发夹结构连接原始链和合成的互补链，测序后的R1和R2来自同一模板（分别来自原始链和互补链），最后通过配对规则进行解析。具体步骤如下：

1、DNA打断为250bp左右长度，两端连接发夹结构的adapter，然后将发夹断开，利用断开的adapter新合成互补链（为茎环结构），此时原始链包含甲基化信息，新合成的互补链不含修饰信息；

2、在新合成的茎环结构的另一端连接接头，然后利用TET2和BGT进行酶转，未甲基化C转化为U；

3、茎环结构打开后连接测序接头进行文库扩增和测序；

4、根据R1和R2的配对规则进行碱基的解析。

这种方式不仅可以判断甲基化修饰，还可以避免PCR错误的引入，同时还可以通过增加额外的步骤来区分5mC和5hmC（Six-letter seq，使用DNMT5酶将5mC的甲基化状态复制到互补链的对应C位点（即CpG对侧））。

二、MCP-seq

该方法采用甲基化敏感酶的方式来检测甲基化，通过针对目标位置的引物设计来实现突变和甲基化的检测。由于该方法在前期构建了pre文库（间接扩大了样本量），所以后续的目标位置检测可以只用少部分文库，支持一次文库构建，多次反复使用。具体步骤如下：

1、DNA打断后进行酶切（甲基化敏感酶，如HhaI，也可用多酶同时切），如限制性内切酶HhaI识别的GCGC如果存在甲基化，则保留，未甲基化则被切成小片段；

2、常规补平加A后加接头形成pre-MCP文库；

3、针对目标位置设计扩增引物，分别对正负链进行两个单链引物的设计，最后加上测序接头；

4、测序后进行分析，突变走正常的带UMI的分析流程，甲基化则根据目标位置reads覆盖情况进行甲基化计算。

该方法的局限性在于检测的甲基化位置有限制，只能是包含酶切位点或者附近位置。而且由于引物的限制，一次检测的突变和甲基化数目也不能太多。

三、Methyl-SNP-seq

该方法与第一种Five-letter seq和类似，均使用了hairpin adapter，后续步骤也类似，但原理上差异较大。five-letter seq通过复制原始链生成无修饰的互补链，两条链分别测序后配对解码，利用两碱基组合（16种状态）区分突变与甲基化信息，而Methyl-SNP-seq是单链保留+单链转化：在对hairpin adapter断开后，用的是甲基化的C（5mC）来合成新链，所以在测完序后read2保留原始序列信息，read1经BS转化后C转为T。这种好处是兼容常规探针捕获进行目标区域富集（无需特殊探针设计）。

四、MethylSaferSeqS

该方法可同时检测突变、CNA和甲基化，而且投入的DNA量要求也比较少。方法的核心是利用含生物素的单引物进行非指数扩增，然后进行链分离，分别构建突变和甲基化文库进行检测。具体步骤如下：

1、首先进行常规文库构建，然后使用带生物素和dU的单引物进行非指数扩增（1-3轮），此时原始链保留甲基化信息，复制链则无；

2、利用链霉亲和素磁珠结合生物素标记的复制链，加热变性实现原始链和复制链的分离；

3、复制链使用USER酶处理后进行突变文库的扩增，原始链则采用常规BS转化后进行文库扩增。

五、MM-seq

该方法的原理就比较简单了，核心是通过修饰过的dCTP合成新链（保留突变信息）。具体步骤如下：

1、DNA打断后接带UMI的接头（接头中的C为甲基化）；

２、使用修饰过的dCTP（避免后续被TET转化）进行新链的合成，然后进行EC的转化；

3、测序后通过UMI进行拆分，UMI中带C的reads用于突变分析（MM-geent），无C的用于甲基化分析（MM-meth）；

六、Methyl-CODEC

方法非常巧妙，核心是特殊的含有甲基化C的四链接头，这个接头四条链形成三个部分互补的双链，与DNA结合后形成类似滚环结构。使用Phi29 DNA聚合酶进行滚环式链置换扩增，扩增时同样使用修饰过的dCTP进行新链的合成。最终产物中新合成的部分保留突变信息，原始链部分则用于甲基化分析。

总结：

每种方法都有着巧妙的构思（酶工程+湿实验+生信分析），对于采用转化（BS或EC）检测甲基化的方法，想尽办法保留原始链的突变的信息（要么将原始链和复制链分开，如MethylSaferSeqS，要么采用修饰过的dCTP来保护突变信息，如five-letter seq、methyl-CODEC等），而对于采用酶切方式检测甲基化的方法则没有此类顾虑，但在分辨率上要略差一些。

方法的创新需要突破酶的限制，要么是现有酶的各种组合来实现目的，要么从头改造和探索。

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