NGS技术专刊第三期：NGS必备之核酸提取

John

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核酸提取
    核酸提取是NGS实验流程中的起点，核酸提取的得率、完整性和纯度直接关系到后续实验的成功与否。
    实验室需要提取各种类型样本的核酸以备后续的文库构建等NGS流程。实体瘤患者的样本类型有石蜡包埋组织、全血、穿刺液、胸腹水等，血液肿瘤患者样本类型主要是全血和骨髓等，生殖遗传的患者样本类型主要有全血、羊水穿刺液、干血斑等，感染性患者的样本类型主要有胸腹水、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液和全血等。根据样本差别，提取的方式、试剂盒也有所不同。


核酸提取基本步骤
1、裂解细胞，释放核酸：使用裂解液破坏样品细胞结构，从而使样品中的核酸游离在体系中；
2、核酸的分离与纯化：将与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子和其他不需要的核酸分子去除；
3、核酸富集与洗脱：采用洗脱液处理吸附有核酸的吸附物，富集得到目的核酸。

常用核酸提取方法
1、溶液法
     比较经典的提取方法，苯酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，变性降解核蛋白，使DNA从核蛋白中游离出来。而DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。离心分层后取水层，经过多次重复操作，并合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇/异丙醇来沉淀核酸，然后再进行分离和纯化、溶解后即可得到高纯度核酸。
    溶液法成本低，但存在有毒试剂，影响操作人员健康，而且较为繁琐，操作时间长，提取的核酸质量也较为一般。


2、柱提法
    利用特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附核酸，而蛋白质、多糖、脂类等基本不吸附，被离心沉淀与核酸分离的原理。硅胶膜表面存在的硅醇基团呈弱酸性，水化后带负电。样品裂解后，如果溶液中存在一定浓度的阳离子时，会中和DNA硅醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA能够牢固地吸附在硅胶膜表面。而当处于低盐水溶液时，DNA磷酸基团和硅胶膜的硅醇基团之间存在排斥，硅胶膜就会把DNA释放出来，从而达到分离纯化核酸的目的。
    柱提法试剂盒价格较低，操作相对简单，在市面上应用较为广泛。但是其对样本需求量大，损失多，对于珍稀样本无能为力，特别是在法医、考古等领域显得力不从心。同时由于需要反复离心不便于高通量、自动化操作等。


3、磁珠法
    与硅基离心柱原理类似，磁性颗粒活性基团在一定条件下可与核酸特异性结合和解离，先使用细胞裂解液裂解细胞，核酸带负电的磷酸基团借由解离的盐离子（如Na+）与磁珠表面羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面，利用磁珠的磁性，可通过外加磁场进行收集洗脱，获得质量较好的核酸模板。
    磁珠法不需要离心、无需加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，但是成本较高。


蛋白酶K在核酸提取中的作用
    蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性。蛋白酶K能降解与核酸结合的蛋白质，分离DNA与蛋白质，使DNA能够更好被提取。还可降解RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase水解模板的RNA，在RNA的提取和检测过程中起到不可或缺的作用。而RNA极不稳定、易于被广泛存在的RNase降解，因此利用蛋白酶创造一个无RNase的环境、严格防止RNase污染是成功提取RNA的关键。
核酸提取的下游应用
1、PCR扩增：从提取的DNA或RNA中扩增目的片段，用于分子诊断、分子生物学研究、药物研发、病毒检测等。
2、实时荧光定量PCR：用于定量检测DNA或RNA的含量，可以用于基因型检测、差异表达分析、细胞数量、病毒载量、转基因生物检测等。
3、基因测序：对提取的DNA或RNA进行测序，用于肿瘤基因组学、新生儿筛查、精准医学和基因诊断等。
4、蛋白质研究：从提取的DNA或RNA中合成蛋白质，用于研究蛋白质结构、功能等。
这些下游应用可以帮助我们更深入地研究生物样本中的DNA或RNA，并揭示它们在生物学、医学等领域中的重要作用。
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