【干货】柱层析技术

千姿百态

适用范围：

• 1.     样品量要适中（适用于g-公斤级），如果样品量只有几百克至一克，可以考虑使用制备TLC纯化（俗称爬大板），既可以得到良好的分离效果，又可以节省大量的纯化时间。
  
• 2.     样品要有良好的溶解性，否则会导致化合物在硅胶上极难解析下来，从而导致硅胶柱堵塞。
  
• 3.     样品在TLC板上产物与杂质点要有一定的分离度，而不是在一个点上，硅胶板的分离效果要高于柱层析，如果硅胶板都显示无法分开的话，尽量不要选择柱层析纯化，而可以考虑使用制备HPLC，SFC或其他分离方法。
  

操作过程：
干法上样为例

• 1.     装硅胶：在减压抽滤的状态下，将硅胶加入玻璃柱中，
  
• 2.     抽结实：减压抽气至10min，将硅胶抽实
  
• 3.     上样：将拌好硅胶的样品，加入硅胶上层
  
• 4.     加石英砂：加入缓冲层
  
• 5.     石油醚淋洗：加入低极性溶剂淋洗，开始润柱时，一定要选取低极性的溶剂淋洗，可以充分稀释残留的大极性溶剂，以免色谱带在柱子上出现抢跑现象
  
• 6.     加缓冲球开始过柱
  

装柱：

• 1.      选择什么类型的柱子
  

加压柱：速度比较易于控制，但是由于需要在柱子上方加装一个磨口，限制柱子直径至多在10cm左右，约束它的的最大上样量。适合小于100-200 g产品的纯化。大尺寸的加压柱难以制作，用起来危险性大。在公司过柱时，请使用双链球加压
减压柱：适用比较广，但是如果控制不好真空度的话，流速会非常快，同时溶剂很大一部分被抽走，适合任何量的过柱, 比加压柱快，需要减小流动相极性过柱(比加压柱小一倍), 不然会导致分离效果差。
常压柱：适用于量大的物料，但流速较慢。适合大于50-100g的产品. 常压柱是分离效果最好的，但是时间也最长。

• 2.      选择多大柱子
  

过柱前知道样品的量，伴样硅胶是样品量的1-2倍，柱子中的硅胶是10-30倍这些硅胶在加入柱子后的径高比在1:5-1:10为比较合适的比例。如果比例太小1:1,1:3，硅胶高度不够，分离度比较差；如果比例太大，1:10,1:20，这样流速会非常慢

• 3.      注意事项及技巧
  

过柱前爬板拿标样，并且NMR确认：过柱前，先拿到标样后，再开始过柱，因为在过柱过程中，你得到点往往比爬小板得到点的要多，如果每个点进行确认的话，时间损耗非常大
取硅胶时必须带口罩：硅胶吸入肺中，是无法代谢出身体的，会得矽肺病
必须时需要碱化硅胶：硅羟基为弱酸性，所以它可以和胺类物质发生反应，从而使化合物难以洗脱下来，需要在过柱前，使用三乙胺或氨甲醇碱化后再开始上样
硅胶可以用量筒量取，质量：体积=1:2，节省时间
上样：1.      上样方式有几种，各有什么特点干法上样:将化合物用低极性溶剂溶解后，加入1-2倍重量的硅胶拌样，而后璇干成砂状，具良好流动性，这种上样的优点是易于操作，谱带比较整齐，但一定注意的是化合物是否有热固稳定性。湿法上样：上样需小心谨慎，操作要求较高，适合易溶化合物，该法优点是非常高效。用少量小极性溶剂溶解样品，缓慢加入柱上层2.      注意事项：a.干法上样时，拌样前样品和溶剂要求干燥（硅羟基与水分的结合是非常紧密的，一旦带有过多的水分进入柱子后，硅胶就会失活，分离效率就会降低）；b.使用干法上样时，大极性的溶解溶剂一定要完全旋掉后才上样（大极性溶剂易导致洗脱剂极性加大，从而产物直接被洗脱下来 过柱接收：1.      流动相极性怎样选择：用TLC板上Rf=0.2-0.3的极性过柱，上下有杂质点时，适当减小极性                       一般选取产物Rf值在0.2-0.3之间的流动相体系比较适合，如果有靠得比较近的杂质，就要酌情减少流动相的极性。2.      怎样接收使产品更纯选择合适极性的流动相：选取流动相的时候，可以多使用几个不同的展开体系，来爬板尝试。接收瓶和接收时机的选择：a.产品没有出来的时候，可以用稍大接收瓶接收；b.产品快出来的时候，用稍小接收瓶接收；c. 产品快要出完的时候，用稍小接收瓶接收。简称“掐头去尾”3.      怎样使过柱接收时间更短在保证产品足够纯度的情况，如何更快速的完成柱层析，下面两点可以帮助提高速度：a.使用梯度淋洗（梯度淋洗具有收尾作用，可以减小谱带的宽度，从而降低收集产品所需的洗脱剂体积，减少了配洗脱剂接收洗脱液以及浓缩所耗费的时间。b. 流动相在旋蒸完后，可以套用，减少配溶剂的时间：使用回收套用的溶剂，这一点，尤其适用比较大量的产品，可减少溶剂获取时间，同时降低分离成本4.      注意事项及技巧a.      使用干燥的流动相，特别是在潮湿的天气，可以用干燥剂干燥流动相后过柱b.      用完溶剂桶及时放回安全的地方c.       尤其是化合物第一次过柱时，产品没有彻底确认之前，不要扔掉其他化合物也不要处理硅胶柱。另外我总结一下湿法过柱的技巧TLC是有机化学家们的眼睛，要想过要柱子，前面一定要点好板子。柱层析里面的门道还是很多的，多少克的硅胶过多少克的产品；根据TLC点板情况，是很复杂，还是很简洁，该选择多少目的硅胶；产物的酸碱性决定我们是用普通硅胶，还是氧化铝进行柱层析；有时候EA/PE体系过不开的体系，尝试用DCM/PE说不定就可以过开等等
分享一下湿法上样的技巧
点好TLC以后，让目标点的Rf值在0.2~0.3,浓缩好粗品后，用少量二氯甲烷溶解，用吸管延着硅胶顶部的柱壁均匀滴下粗样，然后再垫上一层硫酸钠或者石英砂，再加压冲一下，使其充分吸附在顶部硅胶上，再用小极性溶剂，如石油醚先冲一下，稀释一下顶部DCM的浓度，其他过柱技巧参考干法上样。湿法过柱适合一些极性比较大的产品的纯化，另外对一些热敏感的化合物也实用。

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