分子诊断的进步大大改善了疾病诊断，并有助于早期干预和个性化治疗。结核分枝杆菌感染每年造成1000万新发结核病病例和160万结核病相关死亡，在低收入和中等收入国家的影响尤为严重。结核病（TB）发病负担重、隐匿感染与难以留取合格痰标本等因素，进一步加剧了漏诊。传统分子方法如Xpert/Xpert Ultra虽敏感快捷，但对设备要求较高，限制了在基层与资源受限地区的覆盖。CRISPR诊断凭借特异性强、反应温和、读出灵活，已被广泛用于POCT。然而，用于结核病的CRISPR检测在临床转化上仍需要先扩增、后检测，有交叉污染风险，且不适合在资源有限地区使用。 近日，杂志nature communications上发表了一篇题为“Sensitive pathogen DNA detection by a multi-guide RNA Cas12a assay favoring trans- versus cis-cleavage”的文章。作者开发了单管CRISPR结核检测方法ActCRISPR-TB，该方法联用多个RNP来调节反应动力学，在60分钟内达到5拷贝/μL的灵敏度，并在15分钟内检测到阳性患者样本。该方法对成人呼吸道、儿童粪便和成人脑脊液标本的敏感性分别为93%、83%和93%，并在603例临床样本中检测出64%的临床诊断的结核性脑膜炎病例。这种简化的诊断方法，有潜力改善资源有限环境中的分子诊断。
图片来源：Nature communications 在经典RPA-CRISPR体系中，RPA产生的ssDNA/dsDNA产物既能促进Cas12a活化、也可能因被cis裂解而降低扩增效率。作者系统比较了7条gRNA组成的Cas12a RNP在体外的cis与trans活性。结果显示，gRNA-2、-5具有非对称裂解活性，cis裂解活性降低，但在trans活性上与标准gRNA相当（图d）。这种不对称活性使反应动力学更好（图e），减少了扩增子的裂解，从而提高了扩增效率、Cas12a反式裂解动力学和检测信号（图c）。
非对称裂解活性CRISPR使反应动力学更优 图片来源：Nature communications 在总gRNA浓度恒定下，联用多种gRNA可调节反应动力学。结果显示，优化的ActCRISPR-TB gRNA-5实验中添加其他gRNA会显著增加（gRNA-2 > gRNA-3 > gRNA-4）或降低（gRNA-0 >> gRNA-1）其动力学（图g）。最佳三联组合（gRNA-2/-3/-5）的Multi-gRNA ActCRISPR-TB将单管法的检测限优化到5 copies/µL，比使用标准gRNA的检测低20倍，同时还能保持对结核分枝杆菌复合群的种属特异性（图k）。
联用多个gRNA的ActCRISPR-TB 图片来源：Nature communications 作者系统评估了ActCRISPR-TB检测在分析不同类型冷冻保存标本时的诊断性能。在痰标本中（Xpert阳性56例/阴性56例），ActCRISPR-TB在45分钟读数达到93%敏感性与100%特异性（图c）。在一个CD4低且痰菌负担低的HIV队列中，ActCRISPR-TB对TB和未确认TB队列中的总敏感性为80%，对非TB或不大可能TB的特异性为89% (图d)，而Xpert MTB/RIF总敏感性仅约40%，显示单管法在贫菌性样本中的潜在优势。 在支气管肺泡灌洗液（BALF）样本中，ActCRISPR-TB检出47例细菌学确诊TB中的96%，对临床诊断TB（非细菌学证实）检出21%，对非TB为100%阴性（图e）。在呼吸道样本（含痰+BALF）中，与Xpert总体一致性达93%，合并敏感性94%、特异性92%。在儿童粪便样本中，ActCRISPR-TB对粪便样本的敏感性83%、特异性94%。作者还对其诊断肺外结核（EPTB）的能力进行了评估。在疑似结核性脑膜炎成人队列中，ActCRISPR-TB对细菌学确诊TBM的检出率达93%，对临床诊断TBM为64%，总体敏感性明显高于Xpert（约35%）。
ActCRISPR-TB对肺和肺外标本的诊断性能 图片来源：Nature communications 舌拭子样本因无创、易自采，被认为是实现社区广域筛查的关键。作者比较了ActCRISPR-TB与Xpert Ultra在205份舌拭子样本上的表现，结果显示，ActCRISPR-TB敏感性74%，优于Xpert Ultra的56%，两者对53例非TB样本特异性均为100%（图b）。ActCRISPR-TB还检出相当比例由痰涂片或Xpert漏检的病例。 进一步研究表明，ActCRISPR-TB在不同拭子类型间未见显著差异。晨间采样较夜间有更高信号与阳性率。TE保存液在-20℃短期在一周内存储信号稳定，在4℃超过5天或室温超过3-5天存在信号衰减。
ActCRISPR-TB在舌拭子标本中的表现 图片来源：Nature communications 作者改进了ActCRISPR-TB工作流程，采用10分钟热/机械裂解程序来释放Mtb DNA， 45分钟ActCRISPR-TB反应和2分钟LFA孵育步骤，然后采用视觉或智能手机检测方法分别产生定性或半定量结果。优化后的ActCRISPR-TB LFA和台式ActCRISPR-TB检测的灵敏度和特异性总体一致。强度的批内/批间变异系数在10–15%范围内。
舌拭子标本ActCRISPR-TB LFA分析 图片来源：Nature communications 总结与讨论 作者开发了单管CRISPR结核检测方法ActCRISPR-TB，该方法联用多个RNP来调节反应动力学，可以降低扩增子降解，在60分钟内达到5拷贝/μL的灵敏度，并在15分钟内检测到阳性患者样本。该方法对成人呼吸道、儿童粪便和成人脑脊液标本的敏感性分别为93%、83%和93%，并在603例临床样本中检测出64%的临床诊断的结核性脑膜炎病例。ActCRISPR-TB在多种样本类型上达到或超越现参照方法（尤其在非呼吸道样本与舌拭子），且单管化流程降低了污染风险与操作复杂度，符合资源受限环境对快速、可负担、可扩展诊断的要求。这些发现提供了初步的证据，表明使用多个RNPs的RPA-CRISPR分析可以调节分析灵敏度和动力学。如果将其应用于新的分子诊断，就可以开发出敏感和精简的即时检测方法。 |
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